RNA干扰BCRP基因表达逆转乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR耐药性的实验研究

论文摘要

目的多药耐药（multidrug resistance,MDR）是肿瘤的重要耐药机制,是肿瘤化疗失败的主要原因。在人类耐药肿瘤细胞中,几种转运蛋白:P-g蛋白（P-glyeoprotein,P-gp）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-accosiated protein,MRP1～7）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein ,BCRP）与MDR有关,它们为药物排泵,可以导致胞内的细胞毒药物浓度降低,使肿瘤细胞对多种药物产生耐药。乳腺癌细胞中表达BCRP基因则可直接导致细胞耐药性的产生,因此,阻断BCRP基因的达可逆转乳腺癌耐药细胞的耐药性。RNA干扰（RNA interference ,RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）引发的转录后基因沉默机制（post transcriptional gene silencing ,PTGS）。利用RNA干扰技术可设计出针对BCRPmRNA的SiRNA序列、阻断基因表达、逆转耐药性,可望成为肿瘤基因治疗的新手段。因此,设计、构建BCRP特异的RNAi表达体系,分析表达体系对乳腺癌耐药细胞的耐药性的影响,对肿瘤化疗提供新的途径具有重大意义。方法第一部分:针对BCRPmRNA序列,设计、筛选、合成三条SiRNA相关基因片段（BCRP1,BCRP2,BCRP4）,构建出SiRNA的表达载体pGenesil-BCRP-SiRNA-EGFP,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。第二部分: 1)脂质体法转染MCF-7/ADR细胞,G418筛选得阳性克隆。2)半定量RT-PCR和Western-Blot验证SiRNA阻断BCRP基因表达的效率。3)应用MTT法分析MCF-7/ADR的IC50的变化。④筛选出最佳效率的干扰链。结果1)成功构建出针对BCRPmRNA序列的三种SiRNA载体pGenesil-BCRP1-SiRNA-EGFP, pGenesil-BCRP2-SiRNA-EGFP, pGenesil-BCRP4 -SiRNA-EGFP。2)脂质体法转染MCF-7/ADR细胞,G418筛选得各自阳性克隆。3)半定量RT-PCR和Western-blot检测各组BCRP-mRNA及BCRP蛋白的表达,各组干扰链的阻断效果不一,BCRP1组的BCRP-mRNA表达抑制率为30.3%,蛋白表达抑制率为65.6%,与对照组及BCRP2,BCRP4组差别有统计学意义（p<0.05）。4) MTT法分析各组IC50的变化,BCRP1组的IC50明显低于其他组,差别有统计学意义（p<0.05）。结论1)应用表达载体法成功构建BCRP基因特异的SiRNA干扰表达体系pGenesil-EGFP-SiRNA。2) pGenesil-EGFP-SiRNA经脂质体法转染入靶细胞后能够发挥基因沉默作用,但不同链的干扰效果不一,以BCRP1组的干扰效果最佳。3) pGenesil-EGFP-SiRNA经脂质体法转染入靶细胞后,靶细胞的耐药性发生明显变化,不同干扰链的干扰效果不一,以BCRP1组的干扰效果最佳。4)为肿瘤化疗提供理论和实验依据。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
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• 英文摘要
• 论文正文：RNA 干扰介导的 BCRP（乳腺癌耐药蛋白）基因逆转乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR 耐药性的实验研究
• 前言
• 第一部分 BCRP 特异的SiRNA 表达载体构建、鉴定
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 第二部分 pGenesil-BCRP-SiRNA 对BCRP 基因沉默效率的检测
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文