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中药对异育银鲫CYP450的诱导与抑制及对恩诺沙星代谢的影响

2020-12-13阅读(767)

中药对异育银鲫CYP450的诱导与抑制及对恩诺沙星代谢的影响

论文摘要

以异育银鲫（Carassius auratus gibelio）为研究对象,建立异育银鲫肝微粒体CYP1A和CYP3A活性测定方法,在此基础上研究6种中药对CYP1A和CYP3A的抑制效应,进一步探讨了黄连素对CYP1A和CYP3A的抑制机制;同时,研究了中药黄芩苷和甘草酸对恩诺沙星代谢的影响。本论文分为4篇,第一篇为中药提取物对异育银鲫肝微粒体CYP1A和CYP3A的抑制作用;第二篇是黄连素对异育银鲫CYP450 1A和3A抑制机制的探讨;第三篇是黄芩苷与甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内代谢的影响;第四篇是CYP450在恩诺沙星的N-脱乙基中的作用。主要内容如下:1.中药对异育银鲫肝微粒体CYP1A和CYP3A的抑制作用在建立的微粒体体系中,研究黄芩、柴胡、连翘、吴茱萸、野菊花和黄连素等6种中药对异育银鲫肝微粒体P450酶的影响,体外测定IC50以及相关酶动力学参数,并推测其可能的作用机制。结果显示,孵育体系内源性物质不干扰测定,方法快捷、稳定、灵敏度高,且6种中药对7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶（EROD） （CYP1A标志酶）的抑制程度为黄连素>黄芩>连翘>野菊花>柴胡>吴茱萸,IC50依次为0.0038,0.27,2.88,7.62,16.20和16.42 mg/mL,酶促反应动力学常数Vmax和Km为83.33±11.32 pmol/（min.mg）和3.05±0.89μM。据此计算黄连素、黄芩、连翘、野菊花、柴胡和吴茱萸的抑制常数分别为0.00028,0.165,0.39,0.61,0.40和0.59 mg/mL;黄连素、黄芩、连翘和吴茱萸对红霉素-N-脱甲基酶（ERND）（CYP3A标志酶）抑制作用很弱,IC50分别为0.68,90.9,70.8和43.5mg/mL,未检测到柴胡和野菊花对ERND有抑制作用。结果表明,这6种中药对CYP酶的影响因亚型不同而区别较大,对CYP1A的抑制均较显著,而对CYP3A的抑制则不明显;同时研究它们对CYP1A的体外抑制机制,推测黄连素、黄芩、柴胡和吴茱萸对EROD的抑制为竞争性抑制,野菊花和连翘则是反竞争性抑制。2.黄连素对异育银鲫CYP450 1A和3A的抑制机制研究为了深入探讨中药对P450的抑制机制,选择黄连素,在异育银鲫体内从药酶活性、蛋白量和蛋白表达水平,探讨了盐酸黄连素对CYP1A和CYP3A的抑制机制。通过单次腹腔注射不同剂量黄连素（5mg/kg,25mg/kg,50mg/kg和100mg/kg）后研究异育银鲫CYP1A和CYP3A活性的变化规律,低剂量（5mg/kg）时肝微粒体的7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶（EROD）与红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性相比对照组没有变化（p>0.05）,高剂量（25mg/kg,50mg/kg和100mg/kg）肝微粒体EROD与ERND活性均随黄连素剂量增加而降低,最大剂量（100mg/kg）时分别比对照组下降了67.27%和85.83%（p<0.01）。Western-blotting表明,给药组肝脏中CYP1A和CYP3A蛋白含量随黄连素剂量增加依次降低,CYP3A的最高剂量（100mg/kg）相比对照下降了88.6%;而CYP1A给药各组与对照相比没有显著性差异（p>0.05）。定量RT-PCR结果显示,给药组肝脏中CYP1A和CYP3A mRNA含量随黄连素剂量增加依次降低,最高剂量（100mg/kg）相比对照分别下降了85.0%和91.5%。由此说明黄连素对CYP1A和CYP3A的调控为抑制,但抑制机制不同,黄连素对1A的抑制主要发生在转录水平,而对3A的抑制在转录水平和翻译水平都有体现。通过体外孵育实验得出,黄连素对EROD的IC50为11.5μM,抑制动力学常数Km和Vmax为0.83μM和102.04 pmol/min per mg protein,Ki为0.85μM;而在体外,黄连素对ERND的抑制作用很弱,IC50为204.3μM,笔者推测黄连素对3A的抑制作用主要发生的体内。综合体内外实验,笔者建议:在与由CYP 1A和3A参与代谢的药物同时使用时,应注意到黄连素增加联合使用药物的血药浓度,改变其药物代谢动力学.3.黄芩苷与甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内代谢的影响CYP450酶是参与药物代谢的主要的酶系,然而CYP450具有可诱导性,常常会被一些外源性的化学物质（包括许多临床常用药物）所诱导,从而产生药物间相互作用。本文研究了黄芩苷（Baicalin,BL）和甘草酸（Glycyrrhizin,GZ）口灌异育银鲫后对恩诺沙星（Enrofloxacin,EF）在该动物体内代谢的影响。异育银鲫连续7d分别口灌BL（100 mg/kg）、GZ（100 mg/kg）、一组给药后24h腹腔注射EF（10mg/kg）,采用单个动物连续采血,HPLC测定血清EF和环丙沙星（Ciprofloxacin,CF）浓度,分析药动学及其参数;另一组检测肝微粒体CYP1A和CYP3A活性。结果表明,（1）BL和GZ对药物EF的吸收有明显影响,主要表现在峰浓度(Cmax)降低,曲线下面积（AUC）减少。（2）口灌BL和GZ后,实验组EF与CF的AUC与t1/2z明显小于对照组,而清除率（CL）则增大,说明BL和GZ促使EF消除加快。（3）口灌BL和GZ后,BL和GZ的CmaxCF/CmaxEF比值分别1.48%、2.22%,对照为0.95%;BL和GZ的AUCCF/AUCEF比值分别为2.16%、1.76%,而对照组为1.7%。综合CmaxCF/Cmax EF和AUCCF/AUCEF比值可以得出,BL和GZ对EF N-脱乙基具有诱导作用。（4）BL和GZ组7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶（EROD,CYP1A标志酶）和红霉素-N-脱甲基酶（ERND,CYP3A标志酶）活性显著升高（p<0.05）,说明BL和GZ对CYP1A和CYP3A都有诱导作用。结合以上结果,推论BL和GZ加速EF的消除和其代谢产物CF的生成可能与其诱导CYP1A和CYP3A活性有关。4. CYP450在恩诺沙星的N-脱乙基中的作用通过第三篇得到CYP1A与3A的诱导与恩诺沙星代谢相关性较大,本文通过体内诱导诱导和体外抑制CYP450酶后,对异育银鲫恩诺沙星N-脱乙基化代谢的影响。体内试验:异育银鲫连续7d分别口灌β-萘黄酮（BNF）（12 mg/kg）和利福平（RIF）（12 mg/kg）,试验分2组,一组为给药后24 h腹腔注射恩诺沙星（10mg/kg）,采用单个动物连续采血,HPLC测定血浆恩诺沙星和环丙沙星浓度,分析药动学及其参数;另一组提取微粒体,检测肝微粒体CYP1A和CYP3A活性;体外实验:微粒体与恩诺沙星共同孵育,HPLC检测EF的代谢产物环丙沙星的生成率,同时以酮康唑和黄连素作为阴性对照。体内实验结果:（1）口灌利福平和β-萘黄酮后,EF和CF的t 1/2z和AUC均下降,而CLz/F上升,由此可见,2种药物均能促进了恩诺沙星和其代谢产物环丙沙星在体内的消除。（2）口灌利福平和β-萘黄酮后,代谢产物环丙沙星的峰浓度分别为0.435±0.138 mg/L和0.048±0.007 mg/L,对照组为0.099±0.029 mg/L;利福平和β-萘黄酮的AUCCF/AUCEF比值分别为3.69%和1.84%,而对照组为1.76%。综合峰浓度和AUCCF/AUCEF比值,利福平对恩诺沙星N-脱乙基化具有诱导作用。（3）BNF组7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶（EROD,CYP1A标志酶）和RIF组红霉素-N-脱甲基酶（ERND,CYP3A标志酶）活性显著升高（p<0.05）。体外实验结果:RIF组微粒体与恩诺沙星孵育后,环丙沙星生成率上升（p<0.05）,而将酮康唑与空白微粒体一起孵育后,环丙沙星生成率下降（p<0.05）,而BNF组微粒体加BER与EF共同孵育后,CF生成率均没有明显变化（p>0.05）,结合体内外实验结果说明,CYP3A可能参与了在恩诺沙星N-脱乙基化。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 引言
  • 1.C YP450 研究概况
  • 1.1 CYP450 的进化
  • 1.2 CYP450 命名
  • 1.3 CYP450 催化反应机制
  • 1.4 CYP450 的生物学功能
  • 1.5 CYP450 的调控方式
  • 1.5.1 CYP450 的诱导
  • 1.5.2 CYP450 的抑制
  • 1.6 CYP450s 研究方法
  • 1.6.1 体外法
  • 1.6.2 体内法
  • 2. 鱼类CYP450 研究进展
  • 2.1 鱼类CYP450 简介
  • 2.2 鱼类CYP450 对环境污染物的评价研究
  • 2.3 鱼类CYP450 的药理学研究
  • 3. 中药对CYP450 的诱导和抑制研究进展
  • 3.1 含黄酮和黄酮衍生物对CYP450 的影响
  • 3.2 含生物碱类化合物对CYP450 的影响
  • 3.3 含萜类化合物对CYP450 的影响
  • 3.4 含呋喃香豆素类衍生物的药物
  • 4.C YP450 与药物相互作用
  • 4.1 CYP450 的诱导引起的药物相互作用
  • 4.2 CYP450 的抑制引起的药物相互作用
  • 5. 中西药相互作用及其机制
  • 5.1 发生在吸收中的中西药相互作用
  • 5.1.1 破坏胃肠道的酸碱度
  • 5.1.2 生成不溶性螯合物或沉淀
  • 5.2 发生在分布方面的中西药相互作用
  • 5.3 发生在代谢方面的中西药相互作用
  • 6. 本论文研究的目的、意义与主要内容
  • 第一篇 中药对异育银鲫肝微粒体CYP1A 和CYP3A 的抑制作用
  • 1.1 材料与方法
  • 1.1.1 试剂及仪器
  • 1.1.2 实验动物饲养
  • 1.1.3 微粒体制备及蛋白浓度测定
  • 1.1.3.1 微粒体制备
  • 1.1.3.2 蛋白浓度测定
  • 1.1.4 指示酶活性的测定
  • 1.1.4.1 7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶（EROD）
  • 1.1.4.2 红霉素-N-脱甲基酶（ERND）
  • 50'>1.1.5 CYP1A 的IC50
  • 50'>1.1.6 CYP3A 的IC50
  • 1.1.7 中药对鲫肝微粒体药酶的抑制类型分析
  • 1.2 结果
  • 1.2.1 标准曲线
  • 1.2.1.1 蛋白标准曲线
  • 1.2.1.2 试卤灵标准曲线
  • 1.2.1.3 甲醛标准曲线
  • 1.2.2 中药对鲫CYP1A 和CYP3A 抑制作用
  • 1.2.3 中药对鲫CYP1A 抑制类型分析
  • 1.3 讨论
  • 1.3.1 体外抑制试验条件的优化
  • 1.3.2 EROD 和ERND 分别作为CYP1A 和CYP3A 体外探针的可行性
  • 1.3.3 中草药对鲫P450 酶活性的影响
  • 1.3.4 研究中药对CYP1A 的抑制类型以及在安全用药中的意义
  • 第二篇 黄连素对异育银鲫CYP1A 和CYP3A 的抑制机制研究
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 试剂及仪器
  • 2.1.2 实验动物
  • 2.1.3 微粒体制备及指示酶活性的测定
  • 2.1.4 体外酶活性抑制实验
  • 2.1.4.1 EROD 活性抑制实验
  • 2.1.4.2 ERND 活性抑制实验
  • 2.1.5 Western blot 分析
  • 2.1.5.1 样品前处理
  • 2.1.5.2 电泳
  • 2.1.5.3 转膜
  • 2.1.5.4 封闭
  • 2.1.5.5 抗体孵育
  • 2.1.5.6 曝光及显影
  • 2.1.5.7 条带分析
  • 2.1.6 异育银鲫CYP 亚型药酶定量RT-PCR 分析
  • 2.1.6.1 总RNA 的提取
  • 2.1.6.2 定量RT-PCR
  • 2.1.7 数据分析
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 不同剂量黄连素对异育银鲫肝组织中EROD、ERND 活性的影响
  • 2.2.2 黄连素对异育银鲫肝组织中mRNA 表达的影响
  • 2.2.2.1 CYP1A 和CYP3A 以及β-actin PCR 扩增结果
  • 2.2.2.2 引物最佳浓度确定和溶解曲线分析
  • 2.2.2.3 不同剂量黄连素对异育银鲫肝组织中mRNA 表达的影响
  • 2.2.3 不同剂量黄连素对异育银鲫肝组织中CYP1A 和CYP3A 蛋白表达的影响
  • 2.2.4 体外黄连素对EROD 的抑制作用
  • 2.3 讨论
  • 2.3.1 比较Ct 值法相对定量优缺点探讨
  • 2.3.2 黄连素对CYP1A 和CYP3A 的调控机制
  • 2.3.3 黄连素对CYP1A 和CYP3A 的抑制在体内和体外的相关性
  • 2.3.4 黄连素对CYP450 酶系影响的种属相关性
  • 第三篇 黄芩苷与甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内代谢的影响
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 实验药品和试剂
  • 3.1.2 仪器和设备
  • 3.1.3 实验动物
  • 3.1.4 口灌给药与样品采集
  • 3.1.5 血药样品处理及流动相和色谱条件
  • 3.1.6 血样添加诺氟沙星标准曲线
  • 3.1.6.1 标准母液配制
  • 3.1.6.2 标准品标准曲线
  • 3.1.6.3 血清和肝微粒体样中标准曲线
  • 3.1.7 回收率及方法精密度测定
  • 3.1.7.1 回收率
  • 3.1.7.2 精密度
  • 3.1.8 微粒体制备及酶活性测定
  • 3.1.9 数据分析
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 色谱条件的建立
  • 3.2.2 标准曲线及其检测限
  • 3.2.3 回收率
  • 3.2.4 精密度
  • 3.2.5 异育银鲫血清EF 浓度与时间关系曲线
  • 3.2.6 异育银鲫血清EF 药动学参数
  • 3.2.7 异育银鲫血清代谢产物CF 浓度与时间关系曲线
  • 3.2.8 异育银鲫血清代谢产物CF 药动学参数
  • 3.2.9 BL 和GZ 对异育银鲫CYP 活性的影响
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 BL 和GZ 能影响EF 的吸收
  • 3.3.2 BL 和GZ 均能促进EF 及其代谢产物CF 的消除
  • 3.3.3 BL 和GZ 促进CF 血药浓度的增加
  • 第四篇 CYP450 在恩诺沙星N-脱乙基代谢中的作用
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 实验药品和试剂
  • 4.1.2 仪器和设备
  • 4.1.3 实验动物
  • 4.1.4 口灌给药与样品采集
  • 4.1.5 血药样品处理及色谱条件
  • 4.1.6 微粒体制备及酶活性测定
  • 4.1.7 微粒体体外孵育及条件优化
  • 4.1.8 体外抑制研究
  • 4.1.9 数据分析
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 色谱条件的建立
  • 4.2.1.1 异育银鲫血清中EF 和CF 检测色谱条件的建立
  • 4.2.1.2 异育银鲫肝微粒体中EF 和CF 检测色谱条件的建立
  • 4.2.2 标准曲线及其检测限
  • 4.2.2.1 标准曲线及其检测限
  • 4.2.2.2 异育银鲫肝微粒体中EF 和CF 标准曲线及其检测限
  • 4.2.2.3 回收率
  • 4.2.2.4 精密度
  • 4.2.3 异育银鲫血浆恩诺沙星浓度与时间关系曲线
  • 4.2.4 异育银鲫血浆恩诺沙星药动学参数
  • 4.2.5 异育银鲫血浆代谢产物环丙沙星浓度与时间关系曲线
  • 4.2.6 异育银鲫血浆代谢产物环丙沙星药动学参数
  • 4.2.7 BNF 和RIF 对异育银鲫CYPs 活性的影响
  • 4.2.8 最佳蛋白浓度和最佳孵育时间的优化
  • 4.2.9 不同诱导剂和抑制剂对EF N-脱乙基化的作用
  • 4.3 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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