论文摘要
目的 检测人创伤大脑皮层与正常大脑皮层基因表达谱的差异,筛选差异表达基因,寻找脑创伤防治的新的分子生物学策略。 方法 1.收集5例我院神经外科因脑创伤后行颅内减压手术时清除的挫裂伤灶缘相当于伤灶周围水肿区的脑额叶皮层组织,显微镜下清除软膜及血管。受伤至手术取材时间均在48小时内。Trizol一步法提取组织总RNA,并用RNeasy mini spin column过柱纯化,最后用分光光度计定量,甲醛变性胶电泳质检。正常对照的人脑皮层总RNA购自美国Ambion公司。T7promoter-Oligo（dT）15为引物,用cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,双链合成以后用QIAquick PCR Purification Kit纯化。用T7 RiboMAX RNA大量产物系统将双链cDNA进行体外转录合成cRNA。用SuperscriptⅡ反转录酶,随机引物进行反转录,再纯化。再以随机引物进行cDNA的KLENOW酶标记,创伤脑组织掺入Cy5-dCTP、正常对照脑组织掺入Cy3-dCTP。预先用芯片点样仪在75mm×25mm、经过氨基修饰的载玻片上点制21,329条70mer长度的相关基因对应的探针,另外还点上人类的12个看家基因作为阳性对照,12条人工合成的与人基因没有同源性的70mer作为阴性对照,及酵母的8个基因作为基因芯片外标对照。荧光素标记的cDNA探针和芯片在杂交液中42℃杂交过夜,然后洗脱、甩干。最后用LuxScan双通道激光扫描仪扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件读取数据,删除弱点和坏点,用Lowess方法归一化数据及校正;将归一化和校正后的Cy-5/Cy-3值作为差异判别的ratio值,最后以ratio值大于2或小于0.5（即两倍的标准）来确定差异表达基因; 2.随机挑选4个共同差异表达的基因做荧光定量PeR验证; 3.用RT-PCR方法扩大样本验证芯片筛选出的差异表达基因sppl、cyr61、plscrl在人脑创伤皮层中的表达情况。
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