论文摘要
目的:构建肠球菌溶血素cyl基因变异株,研究肠球菌溶血素的毒力,为肠球菌的致病机制及其临床感染的诊断防治奠定基础。方法:通过电转化方法将携带有整个溶血素基因簇的质粒pCGC转入溶血表型和基因型皆为阴性的粪肠球菌EF A7中,构建肠球菌溶血素cyl基因变异株。对变异株的溶血表型,耐药表型进行鉴定。用PCR鉴定原始株、变异株的溶血素基因。建立小鼠腹膜炎模型,比较原始株、变异株对小鼠的LD50;比较腹腔注射相同浓度细菌后小鼠的存活率、外周血白细胞的数量、急性期细胞因子TNF-α的浓度,同时观察死亡小鼠内脏病理切片的改变。结果:1.在选择平板上获得溶血素pCGC质粒的转化变异株。变异株的溶血表型检测可见圆形透亮的β溶血环,壮观霉素抗性筛选有菌落形成,PCR扩增cylA,在琼脂糖凝胶电泳图谱中有一大小约为1kb的清晰条带,而原始株的溶血表型,耐药表型,溶血基因型都为阴性。2.在小鼠腹膜炎模型中:EF A7 cyl mutant比原始株EF A7的半数致死量（LD50）降低了100倍以上。在相同的细菌感染浓度下（5×1010 cfu）下,EF A7 cyl mutant组的存活率为0,原始株EF A7组的存活率为83.33%,差异有显著性。EF A7 cyl mutant组6 h和12 h外周血白细胞分别上升到（11.60±0.28）×109 /L和（14.60±0.36）×109 /L,而原始株EF A7组分别为（7.47±0.17）×109 /L和（8.15±0.15）×109 /L,差异有显著性。EF A7 cyl mutant腹腔注射感染小鼠6 h后腹水中的炎症因子TNF-α的浓度为104.70±3.73 ng/ml,原始株EF A7组为32.86±0.97 ng/ml,差异有显著性。HE病理切片发现,EF A7 cyl mutant感染的小鼠内脏器官有炎症细胞的侵润。结论:1.成功构建肠球菌溶血素cyl基因突变株,并命名为EF A7 cyl mutant。2.肠球菌溶血素在小鼠腹膜炎致病中起重要的作用,是肠球菌的毒力因子之一。