牛瘤胃宏基因组文库的构建及纤维素酶的筛选

论文摘要

纤维素是由p-D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接成直链多糖,是含量最丰富的生物资源。随着社会经济的不断发展,生物资源的利用受到人们越来越多的关注。研究人员发现99 %的环境微生物不能通过纯培养得到。这些未培养微生物成为巨大的、急需开发的基因资源和产业。研究人员为了开发为培养微生物资源,发展了许多新的技术,其中最重要的当数宏基因组文库。在本研究中我们采用间接提取法从牛瘤胃内容物中提取环境总DNA,针对不同的需要使用不同方法纯化提取的DNA,其中为了构建粘粒文库,我们使用改良的化学方法使提取的DNA长度达到2000 Kb且杂质很少能够满足分子生物学实验的要求,可以进行噬菌体转染,为了弥补大片段DNA产量低的缺陷,本课题还采用了传统的DNA抽提方法,提取到大量200 Kb左右的DNA,进行质粒文库的构建。本课题通过平板影印技术在物种鉴别培养基上分别筛选纤维素内切酶,纤维素外切酶,β-葡萄糖苷酶,木聚糖酶和甘露聚糖酶。经过为期一年半的筛选,从文库中筛选到了一个含有β-葡萄糖苷酶的阳性克隆,命名为Cello-1。经过生物信息学分析和原核表达等手段对Cello-1进行的酶学性质的研究仍然在进行中。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 反刍动物的瘤胃
• 1.1.1 瘤胃的结构
• 1.1.2 瘤胃的理化性质
• 1.2 瘤胃微生物
• 1.2.1 瘤胃微生物的多样性
• 1.2.2 瘤胃微生物的研究目的
• 1.3 宏基因组文库技术
• 1.3.1 未培养微生物
• 1.3.2 宏基因组技术起源
• 1.3.3 宏基因组文库分类
• 1.4 构建宏基因组文库的策略
• 1.4.1 基因组DNA的提取与纯化
• 1.4.2 宏基因组文库的构建
• 1.4.3 宏基因组文库的筛选
• 1.4.4 宏基因组学研究现状、问题和展望
• 1.5 纤维素与纤维素酶
• 1.5.1 纤维素的结构
• 1.5.2 纤维素酶
• 1.5.3 纤维素酶研究及实际应用中存在的问题
• 第二章 实验材料
• 2.1 牛瘤胃内容物样品
• 2.2 菌种与载体
• 2.3 主要试剂
• 2.3.1 抗生素
• 2.3.2 试剂
• 2.3.3 工具酶和Marker
• 2.3.4 试剂盒
• 2.4 常用仪器
• 2.5 培养基
• 2.6 常用溶液
• 第三章 牛瘤胃内容物宏基因组文库的构建
• 3.1 实验总流程
• 3.2 牛瘤胃内容物DNA的提取和纯化
• 3.2.1 牛瘤胃内容物DNA间接提取法
• 3.2.2 牛瘤胃内容物DNA的纯化
• 3.3 牛瘤胃宏基因组文库的评价方法
• 3.3.1 16S rDNA引物的选取与PCR扩增
• 3.3.2 PCR产物的纯化与T载体构建
• 3.3.3 阳性克隆的选取和生物信息学分析
• 3.4 牛瘤胃内容物DNA宏基因组文库的构建
• 3.4.1 牛瘤胃内容物DNA酶切时间优化
• 3.4.2 牛瘤胃内容物DNA酶切产物的纯化回收
• 3.4.3 载体的制备
• 3.4.4 酶切片段与载体连接
• 3.4.5 粘粒的包装、转染
• 3.4.6 质粒的电转化
• 3.5 实验结果
• 3.5.1 牛瘤胃基因组的纯化
• 3.5.2 基因组DNA的酶切优化
• 3.5.3 文库的构建
• 3.5.4 文库的评价
• 3.6 小结
• 第四章 β-葡萄糖苷酶的筛选和酶学性质研究
• 4.1 利用牛瘤胃DNA宏基因组文库进行筛选
• 4.1.1 用Whatman 1 号滤纸进行平板影印
• 4.1.2 文库的提取
• 4.1.4 粘粒或质粒的转化
• 4.2 插入片段的分析
• 4.3 插入片段的表达
• 4.3.1 插入片段重组至表达载体
• 4.3.2 重组载体的诱导
• 4.3.3 蛋白质的纯化
• 4.3.4 用考马斯亮蓝染色法测定纯化蛋白的浓度
• 4.4 酶活力测定
• 4.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制
• 4.4.2 β-葡萄糖苷酶酶活力的测定
• 4.5 实验结果
• 4.5.1 筛选结果
• 4.5.2 序列分析结果
• 4.5.3 蛋白质的克隆，表达和纯化
• 4.5.4 酶活力的测定
• 第五章 讨论
• 5.1 宏基因组文库的构建
• 5.2 β-葡萄糖苷酶 Cello-1
• 参考文献
• 致谢
• 论文摘要
• Abstract