钙调蛋白磷酸酶A亚基C末端片段与钙调素溶液中相互作用的结构性质研究

论文摘要

钙调蛋白磷酸酶是唯一一个受钙调素调节的蛋白磷酸酶,有着重要的生理功能作用,然而它的CaM结合区及自抑制区的结构信息却长期处于未知状态。不完善的CN晶体结构阻碍了人们对CNA与CNB、CaM之间,以及CN与底物、调节因子、免疫抑制剂等相互作用机理的深入了解,增加了研究CN在细胞信号传导等过程中所起作用的难度,从而将影响针对包括阿尔茨海默病（AD）、自身免疫性疾病等与CN相关疾病的药物设计与改造。本研究承接实验室以前的结构生物学研究成果,试图通过构建、表达和纯化具有典型意义的CaM作用靶肽Ci,在天然状态下观测其与CaM的复合情况,用圆二色性、核磁共振等生物物理方法测定溶液结构性质,以揭开这一谜团。研究结果揭示天然状态下CaM与Ci在Ca2+存在时很容易结合,且以1∶1的比例复合完全。Ci在自由状态下构象杂乱无章,无规卷曲成分很高,单独测定其三维结构是不现实的;而结合了CaM后Ci结构发生了规则变化,从结合前到结合后可能处于一种卷曲—螺旋的构象跃迁状态之中。结合了Ci的CaM构象较之于其自由状态发生很大改变,经化学位移指认、微扰实验和解离平衡常数计算后可以初步确定两者的结合位点以及作用模式,支持了CaM与CNA C末端片段以对称的同二聚体形式（命名为（CaM·Ci）2）复合的猜想,推断出“NewCBD”可能存在于430-450区间,对现有的C末端功能区划分作出了一些改进。溶液中反映的天然作用信息必然会有助于为困扰多年的CN结构生物学研究提供新的视角,也必然有助于丰富CaM与其靶蛋白相互作用的结构理论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 蛋白质结构域概述
• 1.2 钙调蛋白磷酸酶的结构和功能
• 1.2.1 钙调蛋白磷酸酶的组成研究
• 1.2.2 钙调蛋白磷酸酶的催化特性及催化模式假说的基本步骤
• 2+和CaM的调节'>1.2.3 钙调蛋白磷酸酶的调节机制：受Ca²⁺和CaM的调节
• 1.2.4 钙调蛋白磷酸酶的生物功能
• 1.3 钙调素的结构概述
• 1.3.1 钙调素简介
• 1.3.2 CaM常见的蛋白相互作用结合模式
• 1.4 钙调蛋白磷酸酶CaM结合区及自抑制区结构域已有研究情况
• 1.4.1 难点
• 1.4.2 CBD研究进展——CcL、Cc与CaM复合物晶体结构简介
• 1.4.3 关于CBD与AID整体考虑的新思路
• 1.5 主要方法概述
• 1.5.1 多维核磁共振实验介绍
• 1.5.2 圆二色性
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料、仪器和试剂
• 3.1.1 实验材料和药品
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 试剂和培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 分子生物学构建融合蛋白CciT
• 3.2.2 CciT和CaM的表达
• 3.2.3 CciT和CaM的纯化
• 3.2.4 天然状态下监测CaM和Ci结合
• 3.2.5 圆二色性测定CaM-Ci相互作用
• 3.2.6 核磁共振实验
• 4 实验结果与分析
• 4.1 分子构建结果
• 4.2 蛋白纯化结果
• 4.2.1 CciT 纯化结果
• 4.2.2 凝血酶酶切条件摸索结果
• 4.2.3 Ci和CaM纯化结果
• 4.3 CaM和Ci结合的天然状态监测结果
• 4.3.1 自然胶电泳监测CaM-Ci结合
• 4.3.2 Superdex S75 分子筛监测结果
• 4.4 圆二色性实验结果
• 4.5 核磁共振实验结果
• 4.5.1 1D-NMR实验
• 15N-CaM与¹⁴N-Ci的2D-NMR实验'>4.5.2¹⁵N-CaM与¹⁴N-Ci的2D-NMR实验
• 15N-Ci与¹⁴N-CaM的2D-NMR实验'>4.5.3¹⁵N-Ci与¹⁴N-CaM的2D-NMR实验
• 5 讨论与结论
• 5.1 实验讨论
• 5.1.1 立项讨论
• 5.1.2 蛋白表达及纯化过程中出现的问题
• 5.1.3 NMR测定讨论
• 5.2 实验结论
• 6 展望
• 参考文献
• 致谢
• 拟发表论文