蝴蝶兰、文心兰再生体系的建立及遗传转化体系的初步研究

论文摘要

本试验主要以蝴蝶兰、文心兰作为材料，建立了蝴蝶兰、文心兰的高频再生体系，并在此基础上进行了农杆菌介导的GUS基因的转化，利用共培养后组织化学染色法分析探讨了影响转化效率的各种因素，初步优化了遗传转化体系。主要结果如下：1．蝴蝶兰幼嫩花梗原球茎状体诱导率较高，培养基MS+6-BA 5.0mg／L+NAA 0.5 mg／L诱导率最高，达100％；原球茎增殖的最佳培养基MS+6-BA 3.0 mg／L+NAA 0.2 mg／L+TDZ 0.2 mg／L，增殖系数达2.3；原球茎块在培养瓶内有群体优势效应，切块3.0 mm时增殖系数最大；添加6-BA和NAA的1／2 MS有利于生根，平均根数达到3.2条；室内炼苗3 d+室外炼苗3 d有利于移栽，移栽成活率达90.0％。2．以文心兰花梗为材料，在NAA 1.0 mg／L+6-BA 0.2 mg／L+TDZ 0.3mg／L的培养基上，愈伤组织诱导率最高，可达78％，诱导率受[NAA]／[6-BA]的浓度比和光照强度的影响；在6-BA 0.4 mg／L+NAA 0.2 mg／L的激素组合下，从愈伤组织分化出幼苗的形成率和商品化率可达到最佳效果；中、低无机盐浓度且全量的基本培养基较利于幼苗分化；当分化形成的幼苗株高为1-2cm时，可进一步壮苗生根，生根苗在适宜条件下移栽，成活率可达99％以上。3．以蝴蝶兰原球茎为外植体进行农杆菌介导，优化的转化条件为预培养时间3d，菌液侵染浓度OD600=0.3，菌液侵染时间10 min，pH值=5.4，侵染后，与农杆菌共培养5 d并添加100μmol/L AS，瞬间表达率最高。4．将适宜蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰，仅能得到较低的转化率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一 兰花组织培养的研究进展
• （一） 兰花组织培养的概述
• （二） 兰花组织培养的程序
• （三） 兰花不同外植体的培养
• （四） 兰花组织培养的培养基与激素
• （五） 兰花幼苗生长
• （六） 兰花试管苗移栽
• （七） 兰花施肥技术研究
• （八） 蝴蝶兰组织培养的研究进展
• （九） 文心兰组织培养研究进展
• 二 兰花转基因技术的研究进展
• （一） 基因枪法
• （二） 农杆菌介导法
• （三） 其它转化方法
• 第一章 材料与方法
• 1.1 蝴蝶兰再生体系的建立
• 1.1.1 材料
• 1.1.1.1 品种
• 1.1.1.2 兰花组织培养的培养基
• 1.1.2 方法
• 1.1.2.1 蝴蝶兰花梗茎段芽诱导
• 1.1.2.2 蝴蝶兰原球茎的诱导
• 1.1.2.3 蝴蝶兰原球茎的增殖
• 1.1.2.4 蝴蝶兰出苗和生根培养
• 1.1.2.5 蝴蝶兰的移栽
• 1.2 文心兰再生体系的建立
• 1.2.1 材料
• 1.2.2 方法
• 1.2.2.1 文心兰愈伤组织的诱导
• 1.2.2.2 文心兰愈伤组织的分化
• 1.2.2.3 文心兰壮苗、生根和移栽
• 1.2.2.4 计算方法
• 1.3 蝴蝶兰、文心兰对抗生素的敏感性反应
• 1.3.1 材料
• 1.3.2 方法
• 1.3.2.1 培养基
• 1.3.2.2 接种
• 1.4 蝴蝶兰、文心兰遗传转化体系的初步研究
• 1.4.1 材料
• 1.4.1.1 植物受体材料
• 1.4.1.2 菌株与质粒
• 1.4.1.3 培养基
• 1.4.1.4 培养条件及菌种保存
• 1.4.1.5 溶液的配制
• 1.4.1.6 主要仪器设备
• 1.4.2 方法
• 1.4.2.1 碱法小量提取质粒 DNA
• 1.4.2.2 JM109感受态细胞的制备
• 1.4.2.3 DNA转化感受态
• 1.4.2.4 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 1.4.2.5 液氮冻融法转化农杆菌
• 1.4.2.6 农杆菌Ti质粒DNA提取
• 1.4.2.7 PCR反应
• 1.4.2.8 凝胶电泳
• 1.4.2.9 共培养转化
• 第二章 结果与分析
• 2.1 蝴蝶兰再生体系的建立
• 2.1.1 蝴蝶兰花梗茎段芽诱导技术的研究
• 2.1.1.1 不同灭菌时间对外植体灭菌效果的影响
• 2.1.1.2 不同花梗部位对节芽诱导效果的影响
• 2.1.2 蝴蝶兰原球茎诱导技的研究
• 2.1.2.1 不同激素组合对原球茎体的诱导影响
• 2.1.2.2 大量元素对原球茎诱导的影响
• 2.1.2.3 不同激素组合对原球茎增殖的影响
• 2.1.2.4 不同原球茎切块大小对增殖的影响
• 2.1.2.5 不同激素组合对蝴蝶兰苗生根的影响
• 2.1.2.6 炼苗处理对蝴蝶兰组培苗移栽成活率的影响
• 2.2 文心兰再生体系的建立
• 2.2.1 植物激素对文心兰诱导愈伤组织的影响
• 2.2.2 光照条件对文心兰诱导愈伤组织的影响
• 2.2.3 植物激素对文心兰愈伤组织分化的影响
• 2.2.4 基本培养基对文心兰愈伤组织分化的影响
• 2.2.5 文心兰壮苗生根和出瓶移栽
• 2.3 蝴蝶兰、文心兰对抗生素的敏感性反应
• 2.3.1 卡那霉素对蝴蝶兰、文心兰生长的影响
• 2.3.2 Cef（头孢霉素）对蝴蝶兰、文心兰生长的影响
• 2.4 蝴蝶兰、文心兰遗传转化体系的初步研究
• 2.4.1 不同预培养时间对转化率的影响
• 2.4.2 三种菌株侵染性比较
• 2.4.3 菌液浓度对转化率的影响
• 2.4.4 不同的侵染时间对农杆菌转化的影响
• 2.4.5 不同的转化方法对GUS瞬时表达的影响
• 2.4.6 不同浓度的AS侵染效果的比较
• 2.4.7 共培养时间对转化的影响
• 第三章 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.1.1 蝴蝶兰再生体系的建立
• 3.1.2 文心兰再生体系的建立
• 3.1.3 蝴蝶兰、文心兰对抗生素的敏感性反应
• 3.1.4 蝴蝶兰、文心兰遗传转化体系的初步研究
• 3.1.4.1 预培养对遗传转化的影响
• 3.1.4.2 菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响
• 3.1.4.3 普通农杆菌转化方法的优化
• 3.1.4.4 共培养与转化率的关系
• 3.3 本研究的创新性
• 3.4 研究中存在的问题及展望
• 参考文献
• 附图
• 缩略词
• 致谢
• 在读期间发表所发表论文