论文摘要
随着社会经济发展和人们生活方式的改变,人类疾病谱正在发生变化,慢性肾脏病（CKD）已呈现流行特征,并成为21世纪全球性的公共卫生问题。CKD一旦发展为终末期肾脏病（ESRD）,则必须依赖肾脏替代治疗（RRT）,即血液透析、腹膜透析、或肾移植来维持生命,给患者家庭及社会带来沉重的经济负担和社会压力。因此,早期诊断及防治慢性肾脏病有着特殊重要的意义。研究表明,肾素—血管紧张素—醛固酮系统（RAAS）,尤其是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）在CKD的发生和进展中发挥重要作用。AngⅡ是RAAS系统最主要的效应分子,业已证实AngⅡ不仅通过改变肾小球血流动力学促进肾小球硬化,还可促进系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞增生、生长因子表达及细胞外基质积聚。AngⅡ的作用是通过与Gq蛋白偶联的Ⅰ型血管紧张素受体（AT1受体）完成的,而AT1受体为跨膜糖蛋白,本身不具有酪氨酸激酶（此酶介导有丝分裂的细胞信号）活性,也不直接与酪氨酸激酶发生联系。本研究将深入探讨AngⅡ介导肾小球系膜细胞增殖及炎症介质的表达的信号转导机制,这不仅有助于加深人们对CKD发病机制的认识,同时也为未来CKD治疗策略的制定提供理论依据。本研究包括两部分内容:一、c-Jun氨基末端激酶介导血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达目的:AngⅡ可诱导体外培养的系膜细胞c-Jun氨基末端激酶（JNK）活化,但其活化后的生物学意义仍不清楚。本研究选用新型的JNK特异性阻断剂SP-600125,探讨JNK-c-Jun/AP-1信号通路在AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达中的作用。方法:体外分离培养人肾小球系膜细胞,应用SP-600125预处理后加入AngⅡ刺激,应用Western Blot检测JNK、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）和p38的活性以及c-Jun磷酸化;应用荧光素酶（Luciferase）活性检测法检测c-Jun转录活性及单核细胞趋化蛋白（MCP-1）启动子活性;凝胶电泳迁移率（EMSA）检测活化蛋白-1（AP-1）DNA结合活性;核酸酶保护法检测MCP-1 mRNA表达;ELISA检测培养上清中MCP-1、转化生长因子（TGF-β1）和纤维连接蛋白（FN）的分泌;3H-胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法和细胞计数法测定系膜细胞的增殖。结果:1.AngⅡ可呈时间依赖性和剂量依赖性的方式诱导JNK活化及c-Jun磷酸化,100 nmol/L AngⅡ刺激15 min后,c-Jun磷酸化显著增加,JNK活性明显上调,30分钟达到高峰,是对照组的6.2倍,1 h后几乎恢复到正常水平。2.JNK特异性抑制剂SP-600125呈剂量依赖性的方式抑制AngⅡ诱导的JNK活化和c-Jun磷酸化,当浓度为10μmol/L和20μmol/L时其抑制作用分别达75%和90%,SP-600125对ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均无抑制作用。3.AngⅡ刺激后c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性显著增加,SP-600125可呈剂量依赖的抑制AngⅡ诱导的c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性的增加,20μmol/L SP-600125预处理几乎完全阻断c-Jun的反式激活。4.AngⅡ显著增加MCP-1启动子活性及MCP-1 mRNA表达,SP-600125可呈剂量依赖性的抑制AngⅡ诱导的MCP-1启动子活化和MCP-1 mRNA表达以及系膜细胞MCP-1、TGF-β和FN的分泌。5.1～20μmol/L SP-600125以剂量依赖的方式抑制AngⅡ促进的系膜细胞3H-TdR掺入量和细胞计数的增加,而MEK1/2特异性抑制剂PD-98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580对AngⅡ诱导的系膜细胞数目的增加无抑制作用。结论:AngⅡ→JNK/SAPK→c-Jun/AP-1信号通路在系膜细胞增殖和炎症介质分泌中发挥一定的作用。JNK特异性抑制剂SP-600125能部分抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖和炎症介质分泌。二、血管紧张素Ⅱ通过ROS/EGFR/JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖目的:我们前期的研究发现AngⅡ可通过JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖,但JNK/AP-1活化的上游通路尚不清楚。本研究探讨活性氧（ROS）和表皮生长因子受体（EGFR）在AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化及系膜细胞增殖中的作用并探讨ROS释放的来源。方法:体外培养人肾小球系膜细胞,应用3H-TdR掺入法和细胞计数测定系膜细胞增殖;荧光探针2,7—二氯二氢荧光素乙酰乙酸（DCFDA）检测细胞内ROS产生;化学发光法检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性;实时定量RT-PCR检测NADPH亚基p47phox和p67phox mRNA表达;Western Blot检测p47phox和p67phox膜转位以及EGFR、JNK和c-Jun磷酸化。结果:1、AngⅡ呈时间依赖性和剂量依赖性促进肾小球系膜细胞ROS产生。AngⅡ刺激3 min,系膜细胞内ROS产生明显增加,至60 min达到高峰,系膜细胞ROS产生是对照组2.26倍;1、10、100nmol/L AngⅡ刺激60 min,ROS产生分别是对照组的1.82、2.92和4.08倍。AT1受体（AT1R）拮抗剂losartan完全阻断了AngⅡ诱导的ROS产生,而AT2受体（AT2R）拮抗剂PD123319无抑制作用。2、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI几乎完全阻断AngⅡ诱导的ROS产生,而线粒体complexⅠ抑制剂鱼藤酮（rotenone,ROT）、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇（allopurinol,ALLO）、环氧化酶抑制剂吲哚美辛（indomethacin,INDO）、脂氧化酶抑制剂（nordihydroguiaretic acid,NDGA）、细胞色素P450氧化酶抑制剂酮康唑（ketoconazole,KETO）以及一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-甲酯精氨酸（NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME）对AngⅡ诱导的ROS产生均无明显影响。AngⅡ显著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜转位。3、AngⅡ可呈时间依赖性和剂量依赖性诱导系膜细胞EGFR磷酸化,100 nmol/L AngⅡ刺激30 min,EGFR磷酸化达到高峰,是对照组的3.96倍;AT1受体阻断剂losartan、抗氧化剂乙酰半胱氨酸（NAC）以及NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI显著抑制AngⅡ诱导的EGFR磷酸化,同时EGFR拮抗剂AG-1478几乎完全阻断AngⅡ诱导的系膜细胞增殖。4、Losartan、NAC、apocynin、DPI和AG-1478阻断AngⅡ诱导的JNK/AP-1活化和系膜细胞增殖。结论:ROS/EGFR/JNK/AP-1信号通路参与AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞增殖。NADPH氧化酶抑制剂和EGFR受体拮抗剂能显著抑制AngⅡ诱导的系膜细胞增殖,可能具有一定的治疗作用。本研究创新之处在於:1.首次发现:AngⅡ可通过JNK—c-Jun/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖和MCP-1、TGF-β以及FN表达（参见:Zhang A,Ding G,Huang S,Wu Y,Pan X,Guan X,Chen R,Yang T.c-Jun NH2-terminal kinase mediationof angiotensinⅡ-induced proliferation of human mesangial cells.Am J PhysiolRenal Physiol.2005;288:F1118-1124）。2.首次发现:活性氧依赖的表皮细胞生长因子受体磷酸化介导AngⅡ诱导JNK—c-Jun/AP-1信号通路活化及肾小球系膜细胞增殖（参见:Ding G,Zhang A,Huang S,Pan X,Zhen G,Chen R,Yang T.ANGⅡinduces c-JunNH2-terminal kinase activation and proliferation of human mesangial cells viaredox-sensitive transactivation of the EGFR.Am J Physiol Renal Physiol.2007;293:F1889-1897）。
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