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纳米银增强荧光分析方法的研究与应用

2020-12-28阅读(305)

纳米银增强荧光分析方法的研究与应用

论文摘要

荧光分析是生物研究领域中十分重要的检测方法。如何提高荧光分析灵敏度对于解决低丰度生物标志物的分析测定极为重要。纳米银具有优良的光学特性,当修饰在纳米银表面的荧光分子距离纳米银粒子表面的距离不同时,其荧光特性会发生改变。当有效控制其距离时,纳米银能够增强荧光分子的荧光强度,从而实现荧光分析灵敏度的提高。本论文围绕纳米银的金属增强荧光效应展开了一系列的深入研究,探讨纳米银增强荧光的机理以及增强的规律,发展高灵敏、高特异性的荧光分析方法。主要研究成果如下:1.纳米银聚合探针增强荧光分析方法的研究与应用基于核酸杂交的原理建立了纳米银聚合探针的检测方法,并成功应用于人IgE的灵敏分析检测。两种基于互补性核酸序列修饰的纳米银生物功能探针:Tag-A和Tag-B通过其表面核酸杂交的方式形成了纳米银聚合探针,实现了荧光信号放大的作用。此种探针的信号放大作用一方面来源于荧光分子数目的增加,另外一方面来源于纳米银对荧光分子的金属增强荧光效应。荧光分子距离纳米银的距离为8 nm,此距离为最佳的金属增强荧光距离,纳米银与纳米银之间的距离也通过核酸的长度控制。此种纳米银聚合探针对于人IgE蛋白质的浓度检测范围为 0.49 ng/mL-1000 ng/mL,检测限为 40 pg/mL（211 fM）。2.基于纳米银催化银离子还原的金属增强荧光方法的研究我们发展了一种高灵敏的金属增强荧光方法。此方法基于荧光分子修饰的纳米银催化银离子形成新型银纳米结构。荧光信号随着新型银纳米结构的生成而大大提高,此方法在检测链霉亲和素（Streptavidin,SA）和人IgE中实现了信号放大作用。纳米银探针催化银离子形成的新型银纳米结构可用于人IgE的分析检测,检测人IgE的浓度范围为0.5 ng/mL-16 ng/mL,检测限为0.25 ng/mL。扫描电子显微镜显示聚合的纳米粒子之间具有很小的缝隙,使得荧光分子可以自由吸收与发射光。新型银纳米结构是由纳米银颗粒催化银离子形成的一层疏松银壳,此银壳结构可以大大增强位于内层的荧光分子荧光强度,对于发射波长在436 nm-1000 nm之间的荧光分子均有增强效应。时域有限差分法（Finite-Difference Time-Domain,FDTD）模拟确认了银纳米结构内增强的电磁场,增强的磁场导致强烈的重叠/共振耦合及最终的荧光强度增加。3.纳米银修饰的微阵列芯片的制备与性能研究我们发展了一种纳米银修饰的微阵列芯片作为基底增强荧光的超灵敏荧光分析方法。以银为核,银或金为壳合成制备了粒径不一的复合纳米粒子,研究了其对不同荧光分子金属增强荧光效应的影响。研究发现Ag@Ag复合物是一种通用、高效的金属增强荧光材料,它能使各种荧光分子的荧光强度增大,而Ag@Au只能使发射波长较大的荧光分子的荧光强度增大。当表面修饰有适配体和荧光分子的Ag@Ag复合物作为检测探针时,此探针具有很好的分析性能,可同时检测人IgE和PDGF-BB,检测PDGF-BB的检测限低于0.4 ng/mL。当Ag@Ag复合物用于制备等离子体的微阵列基底时,荧光检测的灵敏度可获得显著提高。检测PDGF-BB的线性范围为16 pg/mL-50 ng/mL,其检测限为3.2 pg/mL,具有重现性好、干扰小等特点。Ag@Ag修饰的等离子体微阵列芯片在检测蛋白质上具有高特异性及高灵敏度的特性,为荧光分析提供了一种新的发展方向。4.纳米银增强荧光共振能量转移传感分析方法的研究我们建立了 一种基于纳米银增强的荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）传感系统并用于人血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）的检测。荧光分子修饰的适配体（Fluorophores-functionalized aptamers）和含有淬灭基团的单链DNA（BHQ-2）杂交形成双链,并通过链霉亲和素（SA）-生物素相互作用连接至SA修饰的纳米粒子表面,形成纳米银增强的FRET传感器。实验结果显示,由于荧光分子和淬灭分子之间的FRET效应,荧光分子的荧光信号发生淬灭现象,传感器的荧光背景信号很低。加入PDGF-BB后,由于PDGF-BB与适配体分子的相互作用,导致BHQ-2的离开,荧光分子荧光信号恢复,蛋白质浓度越高,荧光信号越大。和没有银纳米粒子的FRET传感器以及金纳米粒子偶联的FRET传感器相比,纳米银增强的FRET传感器具有更高的灵敏度,且特异性好。当PDGF-BB浓度在6.2 ng/mL-50 ng/mL及100 ng/mL-500 ng/mL之间具有很好的浓度与荧光信号的相关性,检测限为0.8 ng/mL。5.基于纳米银的磁珠分离与快速检测方法研究我们建立了一种基于纳米银的磁珠快速分离与特异性检测的集成分析方法。纳米银修饰的磁性粒子（MPs-Ag）用于目标分子的捕获、分离和富集,荧光分子修饰的纳米银（Tag）探针用于产生荧光信号。此种方法灵敏度高、特异性好,其检测凝血酶的检测限为2.2 pM,其它蛋白质如人血清白蛋白,溶菌酶和人IgG均无干扰。此种新方法结合了磁珠高效的分离富集功能、适配体的识别功能以及纳米银增强荧光的特性,可以成功用于低浓度蛋白质的快速检测。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 本论文主要创新点
  • 第一章 绪论
  • §1.1 纳米银的功能化修饰
  • §1.2 电化学法
  • 1.2.1 DNA分析
  • 1.2.2 蛋白质分析
  • 1.2.3 其它生物分子分析
  • §1.3 银增强荧光法
  • 1.3.1 纳米银增强荧光
  • 1.3.2 荧光共振能量转移
  • 1.3.3 粒子-粒子/基底相互作用
  • 1.3.4 银膜增强荧光
  • 1.3.5 生物分析应用
  • §1.4 表面增强拉曼散射光谱法
  • §1.5 比色法
  • §1.6 化学发光法
  • §1.7 本论文的主要研究工作
  • 参考文献
  • 第二章 纳米银聚合探针增强荧光分析方法的研究与应用
  • §2.1 引言
  • §2.2 实验部分
  • 2.2.1 材料
  • 2.2.2 仪器
  • 2.2.3 纳米银的制备
  • 2.2.4 Tag-A的制备
  • 2.2.5 Tag-B的制备
  • 2.2.6 Tag-C的制备
  • 2.2.7 分析流程
  • 2.2.8 纳米银增强荧光效应的验证
  • 2.2.9 线性关系和检测限
  • 2.2.10 LSPR峰的测定
  • 2.2.11 透射电子显微镜表征
  • §2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 探针的性质
  • 2.3.2 聚合探针的增强荧光
  • 2.3.3 荧光检测方法的的建立
  • §2.4 结论
  • 参考文献
  • 第三章 基于纳米银催化银离子还原的金属增强荧光方法的研究
  • §3.1 引言
  • §3.2 实验部分
  • 3.2.1 材料
  • 3.2.2 仪器
  • 3.2.3 纳米银探针的制备
  • 3.2.4 蛋白质SA的检测
  • 3.2.5 人IgE的检测
  • 3.2.6 局域表面等离子体共振峰的测定
  • §3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 银纳米结构的金属增强荧光
  • 3.3.2 蛋白质分析检测
  • 3.3.3 银纳米结构增强荧光机制的研究
  • §3.4 结论
  • 参考文献
  • 第四章 纳米银修饰的微阵列芯片的制备与性能研究
  • §4.1 引言
  • §4.2 实验部分
  • 4.2.1 材料和试剂
  • 4.2.2 仪器
  • 4.2.3 Ag@Ag和Ag@Au的制备
  • 4.2.4 荧光分子修饰的纳米银粒子
  • 4.2.5 寡核苷酸修饰的Ag@Ag和Ag@Au
  • 4.2.6 Ag@Ag和Ag@Au的增强荧光效应
  • 4.2.7 Tag-A的制备
  • 4.2.8 人IgE和PDGF-BB的同时检测
  • 4.2.9 Ag@Ag修饰方法的优化
  • 4.2.10 Tag-B和Tag-C的制备
  • 4.2.11 Antibody-Ag和antibody-Ag@Ag的制备
  • 4.2.12 检测PDGF-BB的条件优化
  • 4.2.13 PDGF-BB检测方法的建立
  • §4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 Ag@Ag和Ag@Au的制备
  • 4.3.2 Ag@Ag和Ag@Au的增强荧光效应
  • 4.3.3 Tag-A同时检测人IgE和PDGF-BB
  • 4.3.4 Ag@Ag功能化修饰方法的筛选
  • 4.3.5 Ag@Ag等离子体微阵列芯片的制备
  • 4.3.6 PDGF-BB检测方法的建立
  • §4.4 结论
  • 参考文献
  • 第五章 纳米银增强荧光共振能量转移传感分析方法的研究
  • §5.1 引言
  • §5.2 实验部分
  • 5.2.1 材料与试剂
  • 5.2.2 仪器
  • 5.2.3 纳米银的制备
  • 5.2.4 纳米金的制备
  • 5.2.5 SA修饰的纳米银
  • 5.2.6 纳米银增强的FRET传感器的建立
  • 5.2.7 PDGF-BB检测方法的建立
  • §5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 纳米粒子的表征
  • 5.3.2 纳米银增强的FRET传感器的优化
  • 5.3.3 四种FRET传感器的检测性能比较
  • 5.3.4 PDGF-BB检测方法的建立
  • §5.4 结论
  • 参考文献
  • 第六章 基于纳米银的磁珠分离与快速检测方法研究
  • §6.1 引言
  • §6.2 实验部分
  • 6.2.1 材料和试剂
  • 6.2.2 仪器
  • 6.2.3 Tag的制备
  • 6.2.4 MPs-Ag的制备
  • 6.2.5 MPs-aptamer-A的制备
  • 6.2.6 荧光检测方法的建立
  • §6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 MPs-Ag/Thrombin/Tag复合物的形成
  • 6.3.2 分析条件的优化
  • 6.3.3 纳米银增强荧光分析
  • 6.3.4 荧光分析方法的建立
  • §6.4 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

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