树突状细胞在结肠癌细胞SW620上清液作用下内皮样分化倾向的研究

论文摘要

研究背景树突状细胞（dendritic cell,DC）是在机体的免疫应答过程中发挥着关键作用的细胞群体,其传统的抗原提呈功能近年来已得到广泛的研究。DC的APC功能即在体内激活T细胞反应。DC不仅提成抗原给未致敏的T细胞诱发其反应,而且还能产生刺激分子使静止的T细胞进入细胞周期并刺激它们的活化。然而,多数研究证实肿瘤浸润性树突状细胞的表型及其递呈功能均下降,肿瘤组织分泌多种免疫因子均能抑制DC的成熟,例如IL-10,VEGF或IL-6和M-CSF等。因此,DC的数量及功能成熟与否与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤血管形成是肿瘤迅速生长重要标志。传统理论认为只有通过血管新生（angiogenesis）即预存的内皮细胞经发芽形成毛细血管;血管发生（vasculogenesis）主要在胚胎期,近来研究表明血管发生在成年生物也可实现,肿瘤的血管化作用也包括血管发生,即内皮细胞从不成熟的前体细胞发育而来。目前认为,bFGF、VEGF、HGF与肿瘤血管形成有关。2004年《Nature Medicine》报道Coukos G等在小鼠及人的卵巢癌上发现了一种新型的共表达DC和血管内皮细胞的标志的白细胞群,接着有学者提出了肿瘤相关DC在肿瘤微环境作用下可能发生内皮样分化。这些研究揭示在肿瘤相关环境下DC在抗肿瘤免疫方面受到抑制,部分DC还可能发生内皮样分化,参与肿瘤血管的形成,促进肿瘤生长。国内外近年来关于DC的研究多集中于如何提高DC抗肿瘤的免疫功能等方面,而肿瘤微环境下DC的内皮样分化倾向发生及其机制以及如何参与肿瘤血管的形成等还有待于进一步的研究。目的本实验探讨结肠癌细胞SW620分泌的可溶性细胞因子营造的微环境对人单个核细胞来源的不同时期树突状细胞（Dendritic cells,DCs）分化发育的影响,以及是否发生内皮样分化的倾向。实验方法1.制备结肠癌细胞SW620培养上清液。2.采集健康志愿者新鲜外周血,密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3×106/ml,接种于24孔培养板中,每孔1ml,移入二氧化碳孵育箱（5%CO2,37℃）静置3h,去除悬浮细胞,获取贴壁生长的单核细胞,加入含GM-CSF（100 ng/ml）、IL-4（5ng/ml）和10%自体血清的1640培养液培养DC,诱导组除加入上述培养液外,分别于第2d、7d分组加入SW620培养上清液,隔天半量换液,各诱导7d。分别于第10d和14d收集诱导组DC和对照组DC。3.培养过程中观察细胞形态并计数。各组经荧光素标记抗体后,采用流式细胞技术检测其免疫表型CD86,CD1a,CD11c;免疫荧光法检测各组内皮细胞特异性标志vWF的表达情况;采用RT-PCR检测各组特异标记（CD1a、vWF和CD144）的基因表达;显微镜观察铺有纤维粘连蛋白玻片上各组细胞条索样结构形成情况。4.胰蛋白酶法配合内皮细胞培养基培养原代脐静脉内皮细胞,作为阳性对照组。采用统计学软件包SPSS 12.0进行结果的统计分析,将所得计量数据以平均数±标准差（（?）±s）表示,确定方差齐性后,进行t检验或方差分析,P＜0.05为显著性差异。结果1.正常DC在培养第3d开始出现突起,第5d时突起更加明显,并且第7d大量突起交织,之后细胞逐渐增大变圆,出现悬浮趋势。SW620培养上清液的2d实验组细胞生长过程及其状态明显落后于正常对照组,并且细胞密度较低;而7d诱导组细胞与DC对照组无明显差别。2.流式检测结果:2d诱导组的未成熟DC经SW620培养上清液诱导7d后,DC的特异标记CD86、CD1a、CD11c与正常对照组DC相比,表达率均明显下降且两组间的差异具有统计学意义。7d诱导组的相对成熟DC诱导7d后,与其相对的正常组比较,DC特异标记表达率未见有明显下降,而二组间也无统计学差异。3.免疫细胞化学法检测内皮细胞特异标志vWF结果:用SW620培养上清液诱导的2d诱导组中存在胞浆着色的阳性细胞,提示有vWF的表达,而7d诱导组和正常对照组胞浆着色不明显,而且2d诱导组的阳性区面积百分比和阳性区平均灰度高于其相应正常对照组,且差异具有统计学意义;7d诱导组与其相应正常对照组相比无统计学意义。4.RT-PCR检测各组特异标记的基因表达结果:早期2d诱导组细胞目的基因条带中有CD144、vWF,而CD1a缺失;其相应的正常对照组有CD1a基因的表达,而CD144、vWF低表达。7d诱导组与其相应的正常组比较均有CD1a的表达,CD144、vWF表达不明显。5.显微镜观察条索样结构:2d诱导组细胞在铺有纤维粘连蛋白的96孔板里形成相似于HUVEC阳性对照组的条索样结构;而正常组DC和7d诱导组细胞均未有明显的索样结构形成。结论:1.SW620上清液能抑制DC的生长过程及相关抗原表达,这可能是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一。2.在SW620上清液诱导下,早期未成熟DC与晚期相对成熟DC比较,较高表达内皮细胞特异性标志CD144、vWF,较易形成内皮细胞特异的条索样结构,出现内皮样分化倾向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 树突状细胞在结肠癌SW620上清液作用下内皮样分化倾向的研究
• 引言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 树突状细胞和肿瘤微环境相互关系的研究进展
• 参考文献
• 中英文缩略词对照
• 致谢