苦荞萌发物中营养成分提取测定及黄酮类化合物抗肿瘤活性的研究

论文摘要

萌动是一种神奇的生命现象,是生命发展的最初阶段,也是生物中最有活力的阶段。植物籽粒吸水萌动后会发生一系列的生理代谢变化,主要表现在细胞生理活性的恢复和复杂的生化代谢,从而使籽粒的营养成份发生重大的变化。本文以苦荞萌发物—苦荞芽粉为研究对象,对苦荞萌发过程中营养物质的变化规律及黄酮类化合物的抗肿瘤活性进行了相关的研究。1、苦荞萌发过程中黄酮类化合物含量和查尔酮异构酶活性变化的研究采用铝盐法测定了苦荞萌发（06d）总黄酮的含量。结果表明:随着萌发天数的增加,苦荞萌发物的总黄酮含量逐渐增大,第六天时达到最高,为26.6±1.0mg/g。建立了HPLC法测定萌发（16d）苦荞中芦丁、槲皮素含量的方法,发现苦荞萌发物中黄酮类化合物主要为芦丁和槲皮素。随着萌发时间的延长,芦丁含量不断增加而槲皮素不断降低,值得一提的是,在萌发第三天时,芦丁和槲皮素含量接近1:1。并且发现在萌发过程中查尔酮异构酶（CHI）活性变化与苦荞萌发物中总黄酮含量的变化一致,验证和揭示了查尔酮异构酶（CHI）活性的提高会有效促进总黄酮含量的增加。2、苦荞萌发物中蛋白酶抑制剂和γ-氨基丁酸的提取的研究采用饱和硫酸盐分段层析法提取苦荞籽粒中的蛋白酶抑制剂（TBTI）,对粗酶液进行活性测定,抑制剂样品的活性由对酶活力的抑制作用达到约50%时决定,选50%抑制反应体系,测定出最适蛋白酶浓度:0.25mg/mL,底物（BAPNA）:0.06mM,抑制剂添加量:10μl,最佳保温时间:10min,抑制活力单位:0.3675U,抑制比活力:3.8994 U/mg。采用茚三酮比色法测定了苦荞萌发（06d）天后所得苦荞芽粉中γ-氨基丁酸（GABA）的含量,测定结果发现,随着萌发天数的增加,GABA的含量在0-3天递增,4-6天递减,呈现一定的变化规律,发芽期的GABA含量比籽粒中高。3、苦荞萌发物中黄酮类化合物抗肿瘤活性的研究（1）采用MTT法检测萌发期（16d）的苦荞芽粉醇提物对人乳腺癌MCF-7细胞的作用效果;将HPLC测定出的（16d）芦丁和槲皮素的含量,用其标准品按比例混合后,采用MTT法检测其及芦丁和槲皮素单体对人乳腺癌MCF-7细胞的作用效果。结果表明:①芽粉醇提物有抑制MCF-7细胞的增殖作用,其中萌发第三天（K3）时抑制效果最好,抑制率为38.58±4.98%,并与阴性对照组有显著性差异（P<0.01）.②芦丁和槲皮素标准混合品抑制效果呈现与苦荞芽粉醇提物相似规律,萌发第三天（K′3）时抑制率达62.22±2.74%（此时芦丁和槲皮素质量比接近1:1）。③对槲皮素（Qu）和芦丁（Ru）设置浓度梯度,计算得出槲皮素IC508.55μg/mL,芦丁IC50785.26 ug/mL,槲皮素在较低浓度时对MCF-7细胞就有一定抑制作用,表明槲皮素的抑制效果呈现一定浓度依赖性且抑制效果优于芦丁。④为探明槲皮素与芦丁联用（QR）效果是否优于单体,以K′3为质量参照,与同质量的槲皮素和芦丁单体进行对比,结果表明:抑制作用效果:QR>Qu>Ru,并且在低剂量的情况下,K′3（QR）优于阳性对照（5-FU）并存在显著差异（P<0.01）,证明了槲皮素与芦丁联用时有一定的协同增效作用,具有抗肿瘤药物5-FU的相同作用。（2）将苦荞芽粉醇提物用于第7天培育的鸡胚,观察不同萌发天数苦荞黄酮对鸡胚血管生长高峰期的影响,将不同萌发天数的苦荞芽粉醇提物、芦丁和槲皮素标准混合品及其单体分别添加于鸡胚尿囊绒毛（CAM）表面载体上。两天后观察,苦荞芽粉醇提物组均有抑制CAM血管生成的作用,而且随着苦荞芽粉醇提物总黄酮含量的增加,抑制作用更加明显。其中槲皮素的抑制效果优于芦丁,这与抑制肿瘤细胞增殖的趋势一致。4、苦荞萌发物中黄酮类化合物抗肿瘤活性机理的初步研究采用流式细胞仪检测人乳腺癌MCF-7细胞周期及凋亡率的变化。选取苦荞芽粉醇提物K1、K3、K5和芦丁、槲皮素标准品乙醇溶液K′1、K′3、K′5处理MCF-7细胞48h后,与空白对照组相比较,结果发现:苦荞芽粉醇提物组对人乳腺癌MCF-7细胞周期分布发生了明显变化。细胞分裂周期中G0/G1细胞数量明显减少,S期和G2/M期增多,说明苦荞芽粉醇提物中黄酮类化合物将MCF-7细胞阻滞在了S期和G2/M期。同时苦荞芽粉醇提物各剂量组检测的凋亡率显示随着黄酮类化合物浓度的增加而增大,表明苦荞芽粉醇提物黄酮类化合物能够诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。K′1、K′3、K′5与对空白对照组比较,K′3的效果较为明显（P<0.01）,细胞百分含量阻滞在S期最多,细胞凋亡率最高。表明芦丁和槲皮素标准品联用的乙醇溶液在比例为（1:1）时抗肿瘤活性最好。5、苦荞萌发物对小鼠免疫活性影响的研究选取5d和6d苦荞芽粉、芦丁和槲皮素标准混合品及其单体饲养小鼠。通过迟发型变态反应（DTH）、血清溶血素、NK细胞活性测定（LDH法）和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化（MTT法）测定,表明苦荞芽粉、芦丁和槲皮素标准品均能提高小鼠免疫功能的DTH反应和溶血素水平,增强NK细胞活性并有一定的促进脾细胞转化率的作用。其中芦丁的效果优于槲皮素。表明苦荞芽粉的抗肿瘤作用是通过提高机体的免疫功能来实现的,并且可以看出芦丁和槲皮素在抗肿瘤作用上具有协同作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 苦荞的营养价值
• 1.2 黄酮类化合物的研究现状
• 1.2.1 黄酮类化合物的结构与分类
• 1.2.2 黄酮类化合物的分布
• 1.2.3 黄酮类化合物的提取与测定
• 1.2.4 黄酮类化合物的抗癌作用
• 1.2.5 黄酮类化合物的抗癌机理的研究
• 1.3 蛋白酶抑制剂的研究现状
• 1.3.1 蛋白酶抑制剂（Proteinase Inhibitor，PI）的概述
• 1.3.2 蛋白酶抑制剂提取方法
• 1.3.3 蛋白酶抑制剂抗肿瘤效果研究现状
• 1.4 γ-氨基丁酸的研究现状
• 1.4.1 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的概述
• 1.4.2 γ-氨基丁酸的测定方法
• 1.4.3 γ-氨基丁酸的生理活性及其在食品上的开发利用
• 1.5 萌发对苦荞籽粒营养成份及相关酶的影响
• 1.5.1 苦荞萌发过程中黄酮化合物含量变化的研究
• 1.5.2 苦荞萌发过程中黄酮合成相关酶变化的研究
• 1.5.3 苦荞萌发过程中蛋白酶抑制剂的变化研究
• 1.5.4 苦荞萌发过程中γ-氨基丁酸的变化研究
• 1.6 研究的目的与意义
• 第二章 苦荞萌发过程中黄酮类化合物含量及查尔酮异构酶活性变化的研究
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 苦荞萌发条件及处理
• 2.2.2 苦荞芽粉黄酮类化合物的提取
• 2.2.3 苦荞总黄酮含量的测定
• 2.2.4 芦丁标准曲线的制作
• 2.2.5 苦荞芽中芦丁和槲皮素含量的测定（HPLC 法）
• 2.2.6 查尔酮异构酶（CHI）的活性测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 铝盐显色可见光光度法（芦丁标准工作曲线的绘制）
• 2.3.2 苦荞萌发过程中黄酮类化合物（以芦丁计）含量的测定
• 2.3.3 最佳波长的选择
• 2.3.4 标准曲线的建立
• 2.3.5 苦荞萌发过程中芦丁、槲皮素含量变化
• 2.3.6 苦荞萌发过程中查尔酮异构酶（CHI）的活性变化
• 2.3.7 苦荞萌发过程中CHI 与黄酮含量变化的关系
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 苦荞蛋白酶抑制剂和γ-氨基丁酸提取与测定的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验原料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 主要仪器和设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 苦荞中胰蛋白酶抑制剂的测定
• 3.2.2 苦荞中γ-氨基丁酸的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 垂直电泳仪测蛋白分子量
• 3.3.2 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
• 3.3.3 胰蛋白酶抑制活性
• 3.3.4 γ-氨基丁酸标准曲线的绘制（茚三酮法）
• 3.4 苦荞芽中γ-氨基丁酸的含量
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第四章 苦荞萌发物中黄酮类化合物抗肿瘤活性的研究
• 4.1 实验材料和仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 主要溶液配制
• 4.1.4 主要仪器与设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 体外肿瘤细胞株的培养
• 4.2.2 苦荞芽粉醇提物及芦丁、槲皮素标准混合品体外抗肿瘤作用
• 4.2.3 苦荞芽粉醇提物及芦丁、槲皮素标准混合品体内抗肿瘤作用
• 4.2.4 统计学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 苦荞芽粉（1-6d）醇提物对MCF-7 细胞的增殖抑制率比较
• 4.3.2 芦丁、槲皮素标准混合品对MCF-7 细胞增殖抑制率比较
• 4.3.3 不同浓度槲皮素和芦丁单体对MCF-7 细胞的抑制率比较
• 4.3.4 苦荞芽粉醇提物及混合品对MCF-7 细胞周期分布及凋亡率的影响
• 4.3.5 苦荞芽粉（1-6d）的醇提取物对CAM 组织中血管新生的影响
• 4.3.6 芦丁、槲皮素标准混合品对CAM 组织中血管新生的影响
• 4.3.7 同质量芦丁、槲皮素分别对CAM 组织中血管新生的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 苦荞萌发物对小鼠免疫活性影响的研究
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.1.1 实验原料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 动物和细胞系
• 5.1.4 主要仪器与设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 实验动物分组及处理
• 5.2.2 绵羊红细胞（SRBC）诱导的迟发型变态反应（DTH）
• 5.2.3 对小鼠血清溶血素的影响
• 5.2.4 NK 细胞活性测定（LDH 法）
• 5.2.5 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT 法）
• 5.2.6 统计学分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 迟发型变态反应（DTH）检测
• 5.3.2 血清溶血素的测定
• 5.3.3 NK 细胞活性测定
• 5.3.4 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 一、结论
• 二、本课题研究的创新点
• 三、今后方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 主要研究成果