论文摘要
研究目的：Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein, RKIP）是磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族的成员。具有多种生理学作用（1-7）,对信号传导通路也具有重要的影响。研究发现RKIP是多种恶性肿瘤的转移抑制基因。而其在乳腺癌中的作用尚未完全阐明。本课题的研究目的是探讨RKIP与乳腺癌进展的相关性,判断其是否为乳腺癌的转移抑制基因,调控乳腺癌细胞中RKIP的表达水平能否阻断乳腺癌的转移,从而为乳腺癌的诊断与治疗提供一定的实验依据。研究方法：本课题分三部分进行研究：第一部分：RKIP表达水平的检测,首先应用免疫组化技术对人正常乳腺组织、乳腺增生组织、乳腺导管原位癌、浸润性导管癌以及浸润性导管癌淋巴结转移灶中RKIP的表达和分布情况进行检测,之后应用Real-time RT-PCR、Western Blot对四种人乳腺癌细胞系以及一种乳腺上皮细胞系RKIP表达水平进行分析。第二部分：体外实验分析RKIP对乳腺癌细胞生物学行为的影响,首先应用FuGENE? HD Transfection Reagent将含正义（Sense, Ss）或反义（Antisense, As） RKIP cDNA的表达载体转染高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-435, G418筛选阳性克隆后,分别比较转染前后乳腺癌细胞体外增殖能力、锚定非依赖性生长能力、细胞周期分布、粘附、侵袭和迁移能力的变化。此外,我们还对MDA-MB-435及其转染细胞进行三维培养,了解三维培养体系中细胞形态的改变,同时利用ELISA检测三维培养上清中IL-8水平的改变。第三部分：利用动物模型进行体内实验,将MDA-MB-435及其转染细胞分别接种裸鼠第二对乳腺脂肪垫,待肿瘤生长至直径1-1.5cm后,切除肿瘤,测定肿瘤体积,固定、包埋瘤块,切片,进行免疫组化染色,测定各组肿瘤原发灶中血管生成情况以及RKIP表达水平。再饲养动物四周之后杀鼠,取肺,固定,计数肺转移灶数目并且检测肺中RKIP表达水平。研究结果：第一部分：（1）正常乳腺组织、乳腺增生组织、乳腺导管原位癌中RKIP的表达水平显著高于浸润性导管癌；浸润性导管癌中RKIP的表达水平则显著高于其相应的淋巴结转移灶中RKIP表达。（2）各组细胞RKIP蛋白与mRNA表达无显著区别（P>0.05）,但是乳腺上皮细胞系HBL-100比较乳腺癌细胞系MDA-MB-435、MDA-MB-231、T-47D以及MCF-7的RKIP表达相对较高,高转移性的细胞比较非转移性的细胞具有下降的趋势。第二部分结果表明：（1）Ss、As-RKIP转染组细胞的增殖能力、锚定非依赖性生长能力与空载体组相比无明显差别。（2）RKIP表达水平与细胞粘附能力、侵袭能力及迁移能力呈负相关（3）MDA-MB-435及其转染细胞进行三维培养后,细胞形态发生改变,Ss-RKIP组细胞粘附在一起,呈团形分布；As-RKIP组细胞形态延长,伸出伪足,形成分枝,分枝之间彼此连接形成管样结构。对照组细胞形态则界于二者之间。（4）三维培养上清中IL-8的水平测定显示：IL-8分泌水平RKIP表达水平呈负相关。第三部分体内实验结果表明：（1）裸鼠肺转移灶形成的数目与RKIP表达水平呈负相关。（2）原发瘤灶微血管密度与RKIP表达水平呈负相关。（3）原发灶中Ss-RKIP转染组RKIP表达水平较高,As-RKIP转染组原发灶及肺转移灶中RKIP几乎为阴性表达。结论：（1）临床资料与动物体内实验表明,RKIP的表达水平与乳腺癌的进展呈负相关,RKIP表达水平的下降可能成为预示乳腺癌侵袭转移的一个重要指标。（2）应用流式细胞术测定细胞周期的结果表明,RKIP对细胞周期的分布无明显影响。（3）体外增殖实验、双层软琼脂集落形成实验以及小鼠肿瘤体积测定表明,RKIP表达水平的变化对乳腺癌的增殖能力无明显影响。（4） RKIP表达水平的降低可以增加乳腺癌细胞的体外异质性粘附能力、侵袭与迁移能力以及IL-8的表达,同时增加小鼠体内肺转移灶的数目以及血管生成能力。因此我们认为RKIP是乳腺癌的转移抑制基因而非肿瘤抑制基因。