论文摘要
第一部分HPC通过调节细胞内cAMP水平发挥抗炎效应缺氧预处理（Hypoxia Preconditioning, HPC）是近年对缺氧病理生理机制研究比较集中的热点之一。目前,缺氧预处理被认为是一个复杂的,涉及多因素、多机制的保护过程。最近有研究提示环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）与缺氧预处理时细胞内信号转导密切相关。cAMP是细胞内普遍存在的第二信使,参与调节细胞的许多活动。细胞内的cAMP处于一个动态平衡,胞外刺激可以通过细胞膜上G蛋白耦联受体（G protein coupled recptors, GPCRs）如肾上腺素受体、腺苷受体（A2A及A2B受体）等激活腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase, AC）,催化5’-AMP环化形成cAMP;一旦cAMP达到一定的水平,负反馈机制便自动启动,主要通过两条途径:一是通过β-arrestin使GPCRs失活,减少cAMP的生成,二是通过磷酸二酯酶（PDEs）的作用将其降解为5’-AMP。研究目的本研究利用所在实验室已建立的缺氧预处理动物及细胞模型,探讨:1.缺氧预处理对细胞内cAMP水平的调节机制;2.cAMP信号通路参与缺氧预处理抗炎作用的机制。实验方法和材料一、细胞缺氧预处理模型:细胞置于低氧密闭容器（2%O2）中缺氧45分钟,取出于正常氧环境（21%O2）中复氧20分钟,此为一个循环,重复3个循环。单纯缺氧组一直置于低氧密闭容器（2%O2）中,正常对照组则一直置于正常氧环境（21%O2）中。二、动物缺氧预处理模型:C57BL/6小鼠或CD73基因缺陷小鼠随机分成3组,分别是正常对照组、单纯缺氧组和缺氧预处理组。缺氧预处理组小鼠被放置于可调节氧浓度的湿化密闭容器内,调节氧浓度到8%,维持10分钟,然后氧浓度转换为21%持续10min,如此循环3次。然后取出,置于常氧环境中2小时;单纯缺氧组小鼠也被放置同种容器内,调节氧浓度到8%,维持1小时,取出,置于常氧环境中2小时;正常对照组小鼠在正常氧环境中（氧浓度21%）,不作任何处理。随后各组的小鼠均被置于容器内,调节氧浓度到5%,维持10分钟,令其死亡,手术取出肺组织,立即投入液氮快速冷冻,-80℃冰箱保存备用。三、缺氧预处理对cAMP水平及效应的调节:1、ELISA法检测细胞内cAMP水平2、Western blot方法检测β-arrestin、PDE4B、p38MAPK等蛋白表达水平的变化①细胞总蛋白提取法:常规总蛋白裂解液提取②细胞蛋白分步提取法（两步法）:第一步提取胞浆/胞膜蛋白;第二步提取脂质体/核蛋白3、双荧光素酶报告分析（Dual luciferase reporter assay）检测NF-кB活性:将构建有luciferase reporter的NFкB质粒转染入Hela细胞,在缺氧预处理后,继续缺氧24小时,然后检测Luciferase强度,即NFкB活性。4、RT-PCR检测PDE4B、白介素-6（IL-6）的mRNA水平5、免疫荧光染色检测NFкB的核移位情况研究结果一、缺氧预处理可以明显提高Calu-3细胞和T84细胞内cAMP水平:ELISA检测显示,与单纯缺氧组和正常氧环境组比,缺氧预处理组cAMP水平明显提高。二、缺氧预处理不影响细胞内β-arrestin蛋白总量,但可使位于脂质体上的“有效”β-arrestin减少,阻止GPCRs的失活,从而使cAMP生成增多。三、缺氧预处理可降低PDE4B的转录及表达水平,减少cAMP的降解。四、缺氧预处理能抑制cAMP-PKA-CREB通路下游的p38MAPK的磷酸化。五、缺氧预处理能抑制NF-кB的核移位。六、缺氧预处理能抑制NF-кB的转录活性。七、缺氧预处理能阻止IL-6 mRNA水平的升高。结论一、缺氧预处理可提高细胞内cAMP水平:缺氧预处理一方面可以通过细胞外刺激信号如腺苷酸等的增强,激活腺苷酸环化酶;另一方面可通过对β-arrestin和PDE4B的调节,抑制负反馈途径,共同促进细胞内cAMP的提升。二、缺氧预处理对cAMP的提升,可通过cAMP-PKA-CREB-p38MAPK通路,抑制NF-кB介导的炎症反应。第二部分IκBα的SUMO化修饰参与HPC对NF-κB炎症通路的抑制SUMO化修饰是蛋白质表达后修饰的一种方式,是指小泛素相关修饰物（small ubiquitin-ralated modifier,SUMO）共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上。这个过程类似但又不同于泛素化,与泛素介导蛋白质的降解不同,SUMO化修饰的蛋白质更加稳定。SUMO参与了广泛的细胞内代谢途径,在蛋白-蛋白之间的相互作用、信号转导、核质运输、转录调控等方面均发挥着重要的作用。缺氧预处理是目前对缺氧病理生理机制研究的热点之一,主要指在进行缺氧处理以前,对研究对象给予几次时间较短,程度较轻的“低氧-复氧-低氧-复氧”预适应处理。缺氧预处理是一个复杂的,涉及多因素、多机制的保护过程,其中,对NF-кB介导的炎症反应的抑制是一个比较重要的环节。有研究发现SUMO化修饰可阻止IκBα泛素化,从而抑制IκBα的降解,稳定NF-κB,减轻炎症反应。我们推测,IκBα的SUMO化修饰可能参与缺氧预处理对NF-κB炎症通路的抑制。研究目的本研究利用所在实验室已建立的缺氧及缺氧预处理动物及细胞模型,探讨IκBα的SUMO化修饰是否参与缺氧预处理对NF-κB炎症通路的抑制。实验方法一、细胞缺氧预处理模型:（方法同第一章）二、动物缺氧预处理模型:（方法同第一章）三、在Hela细胞模型中,利用SAE-1过表达上调SUMO-1水平,然后进行缺氧预处理实验,与正常对照组对比研究:1、Western blot方法检测IκBα、SUMO-1-IκBα、pIκBα等蛋白表达的变化。2、双荧光素酶报告法检测NF-кB活性。3、RT-PCR检测IL-6 mRNA水平。四、在Hela细胞模型中,利用shRNA下调SUMO-1水平,然后进行缺氧预处理实验,与正常组对比研究:1、双荧光素酶报告法分析检测NF-кB活性。2、RT-PCR检测IL-6 mRNA水平研究结果小鼠模型中,缺氧预处理可以上调肺组织内SUMO-1修饰的IκBα水平。Hela细胞体外实验中,缺氧可下调上调细胞内SUMO-1修饰的IκBα水平,且呈时间依赖性;反之,缺氧预处理可以上调细胞内SUMO-1修饰的IκBα水平。SAE-1过表达可以阻止缺氧时IκBα的磷酸化及降解。SAE-1过表达可以阻止缺氧时NF-кB由胞浆到胞核的移位。SAE-1过表达可以阻止缺氧时NF-кB转录活性的升高。SAE-1过表达可以阻止缺氧时IL-6 mRNA水平的升高。SUMO-1 shRNA可减弱缺氧预处理对NF-кB核移位的抑制。SUMO-1 shRNA可减弱缺氧预处理对NF-кB转录活性的抑SUMO-1 shRNA可减弱缺氧预处理对IL-6 mRNA水平的抑制。结论一、缺氧预处理可以上调SUMO-1修饰的IκBα水平。二、SAE-1过表达可以阻止缺氧时IκBα的磷酸化及降解,进而抑制NF-кB炎症通路,起到类似于缺氧预处理的保护作用。三、SUMO-1的沉默则可减弱缺氧预处理对NF-кB炎症通路的抑制,即削弱缺氧预处理的保护作用。简而言之,IκBα的SUMO化修饰在缺氧预处理对细胞内NF-кB炎症通路的抑制过程中起重要作用。第三部分IκBα的SUMO化修饰受腺苷相关通路的调节腺苷（Adenosine,Ado）是核苷（Nucleotide）的一种,除参与能量代谢外,还在细胞信号转导途径中的扮演重要角色:腺苷可与细胞膜上的受体结合,通过G蛋白,参与调节多种细胞内活动,包括对炎症反应的调节。研究发现,腺苷与缺氧预处理（Hypoxia Preconditioning, HPC）关系密切。缺氧预处理是目前对缺氧病理生理机制研究的热点之一,主要指在进行缺氧处理以前,对研究对象给予几次时间较短,程度较轻的“低氧-复氧-低氧-复氧”预适应处理。缺氧预处理是一个复杂的,涉及多因素、多机制的保护过程,其中,对NF-кB介导的炎症反应的抑制是一个比较重要的环节。缺氧预处理可以通过腺苷介导的Cullin-1 deneddylation,阻止IκBα的降解,稳定NF-κB,从而阻断其下游炎症反应。SUMO化修饰也可以阻止IκBα泛素化,从而抑制IκBα的降解,稳定NF-κB,减轻炎症反应。从细胞信号转导的角度来看,处于上游的腺苷对下游的NF-κB炎症通路的调节应该是多途径的。我们推测,IκBα的SUMO化修饰可能也是其中重要的一条,换言之,IκBα的SUMO化修饰可能也是腺苷介导的抗炎通路之一。研究目的本研究利用所在实验室已建立的缺氧及缺氧预处理动物及细胞模型,探讨IκBα的SUMO化修饰与腺苷通路的关系。实验方法一、细胞缺氧预处理模型:（方法同第一章）二、动物缺氧预处理模型:（方法同第一章）三、在Hela细胞模型中,利用腺苷拟似剂NECA及阻断剂8-PT对腺苷通路进行激活/阻断实验,然后与正常对照组进行以下对比研究:1、正常氧环境下,激活/阻断腺苷通路后,SUMO-1-IκBα结合蛋白水平的变化（Western blot方法检测）。2、缺氧环境下,激活/阻断腺苷通路后,SUMO-1-IκBα结合蛋白水平的变化（Western blot方法检测）。四、过表达A2AR和A2BR,然后与野生型及阴性对照组比较SUMO-1-IκBα结合蛋白水平的变化。五、动物实验中阻断腺苷通路:敲除小鼠CD73基因（内源性腺苷生成中的关键基因）,然后进行缺氧预处理实验,对比研究,SUMO-1- IκBα结合蛋白水平在阻断前、后的变化。六、在Hela细胞模型中,利用shRNA下调SUMO-1水平,然后进行缺氧预处理实验,双荧光素酶报告法分析检测NF-кB活性,对比研究SUMO-1水平变化对腺苷通路介导的抗炎作用的影响。研究结果在正常氧环境中,添加外源性腺苷可以上调细胞内SUMO-1- IκBα结合蛋白水平,且呈剂量依赖性。在缺氧环境中,添加外源性腺苷仍然可以上调细胞内SUMO-1-IκBα结合蛋白水平,且呈剂量依赖性。在正常氧和缺氧环境中,外源性腺苷上调细胞内SUMO-1- IκBα结合蛋白水平的作用均可被腺苷受体阻断剂8-PT抑制。过表达A2AR和A2BR,可以上调细胞内SUMO-1-IκBα结合蛋白水平。小鼠CD73基因敲除后（CD73-/-）,SUMO-1-IκBα结合蛋白水平明显降低。SUMO-1的沉默可以使外源性腺苷失去对NF-кB活性的抑制作用。结论通过以上研究,我们发现:IκBα的SUMO化修饰受到腺苷相关通路的调节。缺氧预处理可以通过腺苷相关通路,促进IκBα的SUMO化修饰,稳定NF-кB,并因此抑制缺氧时细胞内NF-кB介导的炎症反应。