产核酸酶P1菌株的诱变选育及发酵动力学研究

论文摘要

核苷酸及其衍生物在食品、制药、农业、化妆品制造业及其生化试剂等各个领域都有十分广泛的用途。尤其是在抗病毒、抗肿瘤药物以及在治疗中枢神经系统、循环系统和泌尿系统等疾病方面具有重要作用。因此研究开发经济可行的5’-核苷酸生产技术已引起人们的高度关注。由于酶解法生产5’-核苷酸与发酵法、化学合成法相比具有诸多优点成为目前的热点。本实验从桔青霉发酵液中分离出一株产核酸酶的菌株PJ5。该菌株在原始的培养基中培养72h,核酸酶P1的酶活力可以达到140U并且产酶稳定。通过18Sr DNA序列测定对其进行了分子鉴定,发现其18SrDNA序列与青霉菌Penicillium属中的Penicillium decumbens具有99%的高度同源性。以PJ5为出发菌株,经过紫外诱变、微波诱变和LiCl复合诱变等诱变处理后,采用琼脂块法筛选突变株,共获得了5株变异菌株正突变较大,比出发菌株酶活力提高了28%。选择酶活力最高并能稳定遗传的突变株A51进行下一步的研究,通过摇瓶优化实验,得到A51生长的最适培养基为：蔗糖50g,蛋白胨6g,玉米浆3.0g,麸皮浸出汁（3%） 30mL, MgSO4·7H2O 0.3g, K2HPO4 0.5g, KH2PO4·3H2O 0.5g, ZnSO4·7H2O 0.2g, CaCl2 0.6g, TW80 1.5g。在此培养基条件下,摇瓶发酵酶活从280U/mL提高到439U/mL左右,提高了56.8%。利用30L Bio-Stat plus贝朗全自动发酵罐,初步研究了桔青霉分批液体深层发酵生产核酸酶P1的发酵动力学过程。基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程分别建立了桔青霉发酵过程中的菌体生长、产物合成及底物消耗随时间变化的数学模型。Logistic模型能较好的描述了菌体菌体的生长规律,Luedeking-Piret模型则比较好的反映发酵过程中核酸酶活力与菌体生长的关系。模拟出的模型数据与实验值能较好的吻合,该模型能较好地反映桔青霉在30L的Bio-Stat plus贝朗发酵罐中的发酵过程,可以用来指导工业生产中桔青霉的大规模液体深层发酵。对菌株进行逐级放大发酵试验,从摇瓶发酵到30L、500L、5m3、10m3的发酵罐中,通过对发酵过程控制,核酸酶酶活可以保持在400U以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 核苷酸的性质、功能及用途
• 1.2.1 核苷酸的性质
• 1.2.2 核苷酸的生物学功能
• 1.2.3 核苷酸的用途
• 1.3 核苷酸的国内外研究进展
• 1.4 核苷酸的生产方法概况
• 1.4.1 化学法核苷酸的生产
• 1.4.2 微生物发酵法生产核苷酸
• 1.4.3 酶解法生产核苷酸
• 1.5 核酸酶P1的性质、结构
• 1.5.1 核酸酶P1的性质和用途
• 1.6 工业微生物的菌种选育
• 1.7 培养基的优化
• 1.8 发酵动力学模型
• 1.8.1 菌体生长动力学模型
• 1.8.2 产物生成动力学模型
• 1.8.3 底物消耗动力学模型
• 1.9 研究的目的和意义
• 1.10 研究内容
• 1.10.1 高产核酸酶菌株的诱变选育
• 1.10.2 菌株发酵培养基优化和发酵条件优化
• 1.10.3 菌体发酵动力学研究和生产工艺优化
• 第二章 产核酸酶P1菌株桔青霉的分离
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 分子实验试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 菌种的筛选
• 2.2.2 菌株的形态及分子鉴定
• 2.2.3 菌株产酶遗传稳定性试验
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 菌种初筛
• 2.3.2 发酵能力的初步验证
• 2.3.3 PJ5的发酵产酶能力检测
• 2.3.4 菌株的形态及分子鉴定
• 2.3.5 产酶遗传稳定性试验
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 PJ5的诱变选育及培养基的优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 实验试剂配制
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 PJ5紫外诱变处理
• 3.2.2 微波诱变
• 3.2.3 LiCl诱变处理
• 3.2.4 诱变子的筛选
• 3.2.5 菌株摇瓶液体发酵培养基的优化
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 紫外诱变结果
• 3.3.2 微波诱变的结果
• 3.3.3 LiCl诱变的结果
• 3.3.4 诱变子的筛选
• 3.3.5 菌株发酵培养基的优化
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 核酸酶P1的液体深层发酵及工业化研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 培养基
• 4.1.2 试剂配方
• 4.1.3 主要实验仪器
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 发酵液酶活的测定
• 4.2.2 发酵液菌体干重的测定
• 4.2.3 发酵液中残糖、氨基氮及残磷含量的测定
• 4.2.4 发酵动力学实验
• 4.2.5 逐级放大实验
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 发酵液中残糖、氨基氮及残磷含量的测定
• 4.3.2 桔青霉发酵制备核酸酶P1的发酵动力学研究
• 4.3.3 30L贝朗罐发酵
• 4.3.4 500L发酵罐发酵
• 3发酵罐发酵'>4.3.5 10m³发酵罐发酵
• 4.4 小结与讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录