拟南芥冷敏感突变体chs1相关基因的克隆和功能分析

论文摘要

植物在生长过程中不断会受到外界生物和非生物的胁迫影响。低温作为植物的非生物胁迫之一，严重危害植物的生长发育。同样,由病原物浸害而产生的生物胁迫也对植物有着严重的损害。因此,在民期的进化过程中,植物产生出一整套机制来应对环境胁迫。尽管抵御低深和病原物佼染的机制有很人差别，但越来越多的研究表明，二者之间有着紧密联系，不过其中详细的分子机制还不是非常明确。为进一步明确植物响应低温的分子机制,我们研究井分析了之前报道的冷敏感突变体chs1，chs1-2突变体在常温22℃时与野生型相比没有明显区别,但在22℃生氏2周后移入低温即16℃条件处理1周后，表现出生长停滞、叶片黄化并最终致死的表型。直接在16℃下萌发约3周后也表现出类似的表型。叶绿素测定和离子渗漏率分析表明突变体的叶绿体和细胞膜的完整性都受到了严重损害。实验表明，突变体发生了细胞死亡，并伴随有过氧化氢积累、PR基因上调和SA的积累。这都说明突变体的冷敏感表型实质上是在低温下激活了防卫反应。通过图位克隆我们发现CHSI编码一个TIR-NB类型的R类似（Resistance like）蛋自,缺乏传统R蛋白具有的LRR结构域。组织表达分析显示，CHS1土要在较老的莲座叶中表达，同时在茎生叶、茎、花兽中都有不同程度的表达,但在根和角果中几乎不表达。运用拟南芥原生质体瞬时表达系统,瞬时表达融合蛋自CHS1-GFP和其突变蛋自chsl-GFP,在激光共聚焦显微镜下观察发现,两者均在细胞核与细胞质中存在,说明突变的chs1并没有显著改变CHS1蛋自的亚细胞定位。遗传分析表明突变体chs1是一个隐性的功能发生缺陷的突变体，分别过表达CHS1的TIR和NB结构域可以部分或完全回复chsl突变体的冷敏感表型。通过相关双突变体的表型分析证明chsl突变体的冷敏感表型部分依赖于水杨酸，完全依赖于ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1（EDS1）或PHYTOALEXIN DEFICIENT4（PAD4）,不依赖于NON-RACE-SPECIFIC DISEASE RESISTANCE1（NDR1）。CHS1的转录水平不受温度调控，但在蛋自水平上，CHS1、CHS1-TIR结构域和突变蛋白chsl在低温条件下的积累要高于常温，而CHS1-NB结构域则不受温度影响，而且在高温28℃条件下,CHS1-TIR结构域的降解速度要快于CHS1全长蛋白，并且这种降解不依赖于26S蛋白酶体，CHS1-NB结构域则非常稳定,暗示CHS1-NB结构域的功能之一是稳定CHS1蛋白。为进一步探知参与chsl介导的信号途径的其它组分,我们利用EMS诱变筛选能够回复chsl-2冷敏感表型的回复突变体suppressor of chsl （socl）。经过分析表明,socl chsl-2可以完全回复chsl-2的冷敏感表型、低温下的细胞死亡以及过氧化氢的积累，PR1、PR2基因的表达也回复到了野生型Co1的水平，通过图位克隆发现SOCI编码一个TIR-NB-LRR类型的蛋白，因此推测有可能chsl-2的冷敏感表型是由于突变体中的SOC1在低温下被激活所致。同时我们发现chsl-2在低温条件下与野生型和socl chsl-2相比，SOC1和AtTN2的表达量都显著升高,这也间接证明了SOC1和AtTN2对chsl-2的冷敏感表型有贡献。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 低温对植物的影响
• 1.1.1 低温对植物的危害
• 1.1.2 冷驯化
• 1.2 植物响应低温的信号通路
• 1.2.1 植物对低温的感知
• 1.2.2 低温相关的钙离子信号通路
• 1.2.3 依赖于CBF的信号途径
• 1.2.4 不依赖于CBF的信号途径
• 1.2.5 低温信号途径中的转录后调控
• 1.2.6 低温信号途径中的翻译后调控
• 1.2.7 部分植物激素与低温的关系
• 1.3 植物的防卫反应
• 1.3.1 植物的免疫系统
• 1.3.2 植物的R蛋白
• 1.3.3 TIR-X和TIR-NB蛋白
• 1.3.4 CC-X和CC-NB蛋白
• 1.4 温度对免疫反应的调节
• 1.4.1 温度对植物的免疫反应的影响
• 1.4.2 温度对R蛋白亚细胞定位的影响
• 1.4.3 SA与ABA对免疫反应的影响
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株材料
• 2.1.3 主要载体
• 2.1.4 主要工具酶与试剂
• 2.2 实验仪器、培养基和试剂配制
• 2.2.1 主要培养基配制
• 2.2.2 转化拟南芥试剂
• 2.2.3 抗生素配制
• 2.2.4 烟草瞬时表达注射悬浮液
• 2.2.5 Western blot试剂
• 2.2.6 实验仪器
• 2.2.7 其它常用溶液配制
• 2.2.8 植物材料培养基质
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 植物材料培养
• 2.3.2 植物基因组DNA提取
• 2.3.3 植物总RNA的提取
• 2.3.4 反转录
• 2.3.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）
• 2.3.6 拟南芥离子渗漏率测定
• 2.3.7 台盼蓝（Trypan blue）染色
• 2.3.8 DAB染色
• 2.3.9 SA提取和测定
• 2.3.10 拟南芥转基因
• 2.3.11 PCR扩增
• 2.3.12 PCR和酶切产物回收
• 2.3.13 质粒DNA提取
• 2.3.14 质粒和连接产物的热击转化
• 2.3.15 大肠杆菌超级感受态的制备
• 2.3.16 农杆菌感受态的制备
• 2.3.17 电击转化农杆菌感受态
• 2.3.18 本实验所用到的载体构建
• 2.3.19 植物蛋白提取
• 2.3.20 Western blot
• 2.3.21 拟南芥原生质体瞬时表达系统
• 2.3.22 chs1-2的EMS诱变
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 突变体chs1-2的性状分析
• 3.1.1 chs1-2的冷敏感表型分析
• 3.1.2 chs1-2的细胞死亡和活性氧积累
• 3.1.3 chs1-2的PR基因表达状况和水杨酸的积累
• 3.2 突变体chs1-2活性氧相关基因的表达
• 3.3 CHS1的图位克隆
• 3.3.1 CHS1的定位与生物信息学分析
• 3.3.2 CHS1的基因组互补
• 3.3.3 冷敏感突变体chs1具有剂量依赖效应
• 3.3.4 CHS1基因内抑制子回复突变体chs1-2的冷敏感表型
• 3.4 CHS1的表达模式分析
• 3.4.1 CHS1的组织表达模式
• 3.4.2 CHS1的亚细胞定位
• 3.5 过表达CHS1-TIR和CHS1-NB结构域植株的表型和性状分析
• 3.5.1 过表达CHS1-TIR和CHS1-NB结构域植株的表型分析
• 3.5.2 过表达CHS1-TIR和CHS1-NB结构域植株的细胞死亡和过氧化氢积累分析
• 3.5.3 过表达CHS1-TIR和CHS1-NB结构域植株PR基因的表达分析
• 3.6 CHS1下游调控因子的分析
• 3.6.1 chs1-2的冷敏感表型部分依赖于SA
• 3.6.2 chs1-2的冷敏感表型完全依赖于EDS1或PAD4
• 3.7 CHS1的稳定性分析
• 3.7.1 CHS1转录水平稳定性分析
• 3.7.2 CHS1蛋白的稳定性分析
• 3.7.3 CHS1 TIR和NB结构域的稳定性分析
• 3.7.4 高温对CHS1、TIR和NB结构域的影响
• 3.7.5 CHS1-TIR的降解不依赖于26S蛋白酶体途径
• 3.8 CHS1抑制子的筛选
• 3.8.1 chs1-2回复突变体的筛选
• 3.8.2 SOC1的图位克隆
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 突变蛋白chs1没有改变CHS1的亚细胞定位
• 4.2 突变体chs1的冷敏感表型可能有TIR-NB-LRR类型R蛋白的参与
• 4.3 突变体chs1是一个隐性功能有缺陷的突变体
• 4.4 CHS1的转录后水平受到温度的调控
• 4.5 CHS1是植物生长动态平衡的调节子
• 4.6 CHS1可能的工作模型
• 4.7 不同研究组对CHS1功能研究的比较
• 4.7.1 CHS1的表达模式
• 4.7.2 CHS1的亚细胞定位
• 4.7.3 chs1的冷敏感表型与SA的关系
• 4.8 展望
• 第五章 结论
• 5.1 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历