稻瘟病菌中Chm1假定调节蛋白的初步鉴定与功能分析

论文摘要

PAK是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是小G蛋白的靶标蛋白。PAK家族蛋白在结构上含有一个高度保守的p21结合区域（PBD domain）,其由90个氨基酸组成,是GTPase的结合位点。稻瘟病菌Chml是PAK家族的一员,通过PBD结构域与小G蛋白Rac1互作,参与了细胞骨架重组,在稻瘟病菌分生孢子的形成过程中起着重要的作用。本研究通过生物信息学的方法,预测了与Chml相关的蛋白,并且对其中的三个基因MoGvp36（MGG01508）, MoZds2 （MGG03837）, MoBoi2（MGG07310）进行了初步的研究。qRT-PCR结果分析表明,在Δchml突变体中,上述三个基因的相对表达量变化发生了轻微变化。利用同源重组原理,对该三个基因进行敲除,初步功能分析发现：MoZds2可能参与了病菌的营养生长及致病性；MoBoi2可能在气生菌丝的生长中发挥一定作用。同时,通过酵母双杂交试验,证实了Chml与MoGvp36, MoBoi2不存在直接的互作关系。此外,综合运用高通量iTRAQ和RNA测序技术筛选Chml相关蛋白,分析得到蛋白水平和转录水平上均发生变化的45个基因。通过研究Chmml相关蛋白,特别是与产孢相关的基因,可以进一步明确并且阐述Rac1-Chm1信号途径在稻瘟病菌的产孢过程中所起到的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 稻瘟病
• 1.2 稻瘟病菌
• 1.2.1 稻瘟病菌的特征
• 1.2.2 稻瘟病菌的侵染机制
• 1.2.3 稻瘟病菌基因研究
• 1.3 PAK家族蛋白
• 1.3.1 PAK家族种类
• 1.3.2 PAK蛋白结构
• 1.3.3 PAK活化机制
• 1.3.4 PAK生物学功能
• 1.4 GVP36蛋白相关研究
• 1.5 ZDS蛋白相关研究
• 1.6 BOI蛋白相关研究
• 1.7 本研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株及植物材料
• 2.1.2 实验质粒
• 2.1.3 实验培养基
• 2.1.4 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物信息学方法
• 2.2.1.1 稻瘟病菌中Chm1相关蛋白的获得
• 2.2.1.2 目的蛋白氨基酸序列系统进化分析
• 2.2.2 稻瘟病菌基因敲除
• 2.2.2.1 稻瘟病菌基因敲除策略
• 2.2.2.2 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 2.2.2.3 稻瘟病菌原生质体的制备
• 2.2.2.4 转化稻瘟病菌原生质体及阳性克隆验证
• 2.2.3 敲除转化子的表型分析
• 2.2.3.1 菌落生长速度测定试验
• 2.2.3.2 产孢量统计试验
• 2.2.3.3 孢子萌发及附着胞形成试验
• 2.2.3.4 大麦离体接种试验（菌丝块）
• 2.2.3.5 水稻活体喷雾接种试验（孢子液）
• 2.2.4 酵母双杂
• 2.2.4.1 供试载体（BD载体）的构建
• 2.2.4.2 酵母感受态细胞的制备和转化
• 2.2.4.3 MoGvp36-BD,MoZds2-BD和MoBoi2-BD自激活试验
• 2.2.4.4 MoGvp36-BD,MoZds2-BD和MoBoi2-BD重组质粒对AH109细胞毒性检测
• 2.2.5 稻瘟病菌总RNA的提取（菌丝体）
• 2.2.6 PCR,逆转录RT-PCR及荧光定量PCR（qRT）
• 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化
• 2.2.8 质粒DNA的提取
• 2.2.9 质粒酶切与连接
• 2.2.10 高通量iTRAQ技术
• 2.2.11 RNA-SEQ技术
• 3 结果与分析
• 3.1 稻瘟病菌中Chm1相关蛋白的生物信息学预测
• 3.2 MoGvp36,MoZds2和MoBoi2生物信息学分析
• 3.2.1 MoGvp36生物信息学分析
• 3.2.1.1 MoGvp36同源蛋白系统进化分析
• 3.2.1.2 MoGvp36蛋白亚细胞定位分析
• 3.2.2 MoZds2生物信息学分析
• 3.2.2.1 MoZds2同源蛋白系统进化树分析
• 3.2.2.2 MoZds2蛋白亚细胞定位分析
• 3.2.3 MoBoi2生物信息学分析
• 3.2.3.1 MoBoi2同源蛋白系统进化树分析
• 3.2.3.2 MoBoi2蛋白亚细胞定位分析
• 3.3 Chml突变体中相关基因的相对表达量分析
• 3.4 MoGvp36,MoZds2,MoBoi2功能分析
• 3.4.1 目的基因突变体的获得
• 3.4.2 MoGvp36基因功能分析
• 3.4.2.1 MoGvp36突变体的菌落形态观察及生长速度测定
• 3.4.2.2 MoGvp36突变体的产孢量统计
• 3.4.2.3 MoGvp36突变体的孢子萌发率及附着胞形成
• 3.4.2.4 MoGvp36突变体的致病性分析
• 3.4.3 MoZds2基因功能分析
• 3.4.3.1 MoZds2突变体的菌落形态观察及生长速度测定
• 3.4.3.2 MoZds2突变体的产孢量统计
• 3.4.3.3 MoZds2突变体的孢子萌发率及附着胞形成
• 3.4.3.4 MoZds2突变体的致病性分析
• 3.4.4 MoBoi2基因功能分析
• 3.4.4.1 MoBoi2突变体的菌落形态观察及生长速度测定
• 3.4.4.2 MoBoi2突变体的产孢量统计
• 3.4.4.3 MoBoi2突变体的孢子萌发率及附着胞形成
• 3.4.4.4 MoBoi2突变体的致病性分析
• 3.5 酵母双杂验证目的蛋白与Chml的互作关系
• 3.5.1 目的蛋白BD载体的构建
• 3.5.2 目的蛋白BD载体自激活试验
• 3.5.3 酵母双杂验证互作实验
• 3.6 MoGvp36,MoZds2,MoBoi2突变体背景下Chml的表达水平
• 3.7 iTRAQ和RNA-SEQ关联分析筛选Chm1相关的产孢基因
• 4 讨论
• 4.1 MoGvp36,MoZds2,MoBoi2与Chm1的关系
• 4.2 关于MoGvp36功能的探讨
• 4.3 关于MoZds2功能的探讨
• 4.4 关于MoBoi2功能的探讨
• 4.5 关于Chm1其他相关蛋白的探讨
• 5 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢