农药类环境激素低剂量暴露对鲫鱼内分泌干扰效应及生物标志物研究

论文摘要

本文以典型农药类环境激素甲草胺、阿特拉津为对象,选用鲫鱼为模式生物,研究不同剂量、尤其是低剂量甲草胺、阿特拉津暴露对鲫鱼的生殖、内分泌和免疫功能的影响。试验设计甲草胺和阿特拉津的暴露浓度为:1/8、1/16、1/64、1/256、1/1024、1/4000 LC50,采用半静态水体染毒方法,试验期间每天更换一半染毒溶液,以确保暴露浓度恒定不变,持续染毒2个月。应用分子生态毒理学等研究方法及体内、体外相结合手段,开展环境激素作用机理和剂量-效应关系研究,尝试建立低浓度暴露生态毒理学研究方法体系,寻找水环境污染的早期预报的生物标志物,为环境激素的生态和健康风险评价提供科学依据和技术支持。主要研究结果如下:1、低剂量甲草胺及阿特拉津暴露可抑制鲫鱼的肝脏和精巢的生长、发育,使性腺指数和肝腺指数明显下降,作用影响呈非单调剂量效应关系。观察组织切片发现,甲草胺及阿特拉津暴露可损伤鲫鱼肝脏细胞结构,使肝脏细胞出现空泡、坏死、细胞肿大、胞质疏松等病理变化;并破坏鲫鱼精巢结构,影响其生殖能力,具有生殖毒性。2、低剂量甲草胺及阿特拉津暴露对鲫鱼肝脏谷胱甘肽（GSH）和激素代谢关键酶[谷胱甘肽硫转移酶（GST）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDPGT）]活性的影响进行评价。结果表明,甲草胺及阿特拉津对上述各个酶系产生一定的干扰,呈现非单调剂量效应关系。GST和UDPGT活性及GSH含量对甲草胺、阿特拉津暴露均较敏感,这些指标从分子水平上反映了污染物对鱼体肝细胞的损伤,影响鲫鱼体内血清激素的平衡,造成内分泌系统的干扰危害,引起一系列的生理生化反应。3、采用放射免疫技术,研究低剂量甲草胺和阿特拉津暴露对鲫鱼性激素[17β-雌二醇（E2）、睾酮（T）]及甲状腺激素[促甲状腺激素（TSH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）]的影响。结果表明,甲草胺可使鲫鱼体内的血清激素E2、TSH和T3水平上升,而T的水平下降。阿特拉津可使E2和T3水平上升,而对T及TSH没有显著影响。研究显示,鲫鱼体内血清性激素E2/T的比值是一种可以有效地指示污染水体中这两种农药类环境激素对鱼类的内分泌干扰毒性的生物标志物。4、鲫鱼UDPGT作为E2激素代谢关键酶,在UDPGT受明显抑制的情况下,无法代谢体内产生的E2,使得E2得以在体内累积,表现为明显负相关的趋势。并且GST在调节甲状腺激素水平的过程中起重要作用,随着甲草胺及阿特拉津的染毒浓度增加GST酶活力下降而T3水平则持续上升。鲫鱼肝脏激素代谢关键酶的活性的改变,可影响鲫鱼体内激素的水平,表明内分泌干扰效应的机制。5、研究建立测定鲫鱼卵黄蛋白原的间接竞争ELISA方法。结果表明,鲫鱼VTG为二个150、160kda的同源二聚体。低剂量的甲草胺和阿特拉津都能够诱导雄性鲫鱼体内产生卵黄蛋白原（VTG）。经低剂量甲草胺染毒后,鲫鱼体内VTG总体呈现为倒“U”型。而经阿特拉津诱导的鲫鱼体内的VTG呈现为不规则的波动,无明显剂量效应关系,对于鲫鱼而言,阿特拉津表现出内分泌干扰活性弱于甲草胺。并且雄鱼体内的VTG积累到一定程度以后,能导致肝、肾等各种组织病变。6、提取鲫鱼血液总DNA,通过RAPD试验筛选出合适的引物,结果表明,低剂量甲草胺和阿特拉津暴露对鲫鱼DNA有损伤作用,可引起鲫鱼DNA序列发生变化,使DNA片断缺失或增加,并且基因多态性增加,存在一定的至突变性,呈非单调剂量-效应关系。7、从鲫鱼血液中分离淋巴细胞体外培养,采用噻唑蓝（MTT）比色法开展对淋巴细胞生长活性的影响实验,结果表明,两种环境激素对淋巴细胞活性的抑制作用存在较明显的剂量-效应关系,甲草胺和阿特拉津对淋巴细胞的半数抑制浓度分别为27.7±7.6μg/L和97.6±26.4μg/L。两种环境激素对鲫鱼淋巴细胞增殖的影响实验结果表明,甲草胺在浓度达到7μg/L时就对淋巴细胞增殖产生明显的抑制作用,而阿特拉津则在浓度达到50μg/L时才对淋巴细胞增殖产生抑制作用。8、从鲫鱼头肾中分离纯化得到巨噬细胞,体外培养,用甲草胺和阿特拉津染毒。结果表明,甲草胺和阿特拉津对巨噬细胞的半数抑制浓度分别为68.2±7.1μg/L和153.9±23.5μg/L。甲草胺和阿特拉津对鲫鱼巨噬细胞产生超氧阴离子（O2-）活性的影响实验结果表明,两种环境激素均可抑制巨噬细胞产生超氧阴离子（O2-）活性,呈非单调剂量-效应关系。9、甲草胺和阿特拉津对细胞酶活的影响实验结果表明,两种环境激素对淋巴细胞的乳酸脱氢酶（LDH）酶活和巨噬细胞的LDH与酸性磷酸酶（ACP）酶活的抑制作用表现出明显的剂量-效应关系。由此可推测,甲草胺和阿特拉津对细胞酶活的抑制效应可能是其对鲫鱼淋巴细胞和巨噬细胞活性功能产生影响的主要原因。10、通过活体染毒试验,采集血液样本,进行淋巴细胞增殖实验及血液白细胞计数。结果表明,低剂量甲草胺和阿特拉津染毒组的淋巴细胞增殖水平与对照组相比均有不同程度的下降,血液白细胞数与对照组相比也均有明显下降。无论是体外染毒还是低剂量活体暴露实验均表明,当甲草胺和阿特拉津达到一定浓度后,对鲫鱼淋巴细胞和巨噬细胞的活性功能均表现出抑制作用,表明这两种环境激素对鲫鱼存在潜在的免疫毒性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 环境激素概述
• 1.1.1 环境激素的概念及内涵
• 1.1.2 环境激素的种类
• 1.1.3 环境激素的作用特点
• 1.1.4 农药类环境激素种类及污染特点
• 1.1.5 我国农药类环境激素使用现状
• 1.2 环境激素毒理学
• 1.2.1 对内分泌系统的影响
• 1.2.2 对生殖系统的影响
• 1.2.3 对免疫系统的影响
• 1.2.4 对神经系统的影响
• 1.3 环境激素可能的作用机制
• 1.4 环境激素的低剂量效应
• 1.5 环境激素对鱼类的生态毒理效应
• 1.5.1 水中农药污染现状
• 1.5.2 农药对鱼类的影响
• 1.6 环境激素生态毒理学研究方法
• 1.7 研究背景、目标、内容和技术路线
• 1.7.1 研究背景
• 1.7.2 研究目标
• 1.7.3 研究对象
• 1.7.4 研究内容
• 1.7.5 技术路线
• 第二章 低剂量环境激素对鲫鱼肝脏、精巢生长的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验动物及饲养条件
• 2.1.4 实验设计
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼的急性毒性
• 2.2.2 低剂量染毒浓度设计
• 2.2.3 甲草胺和阿特拉津色谱图
• 2.2.4 低剂量环境激素暴露对鲫鱼GSI 和HSI 的影响
• 2.2.5 低剂量环境激素暴露对鲫鱼肝脏和精巢组织的影响
• 2.3 小结
• 第三章 低剂量环境激素对鲫鱼激素代谢关键酶的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 蛋白质测定的标准曲线
• 3.2.2 低剂量环境激素对鲫鱼激素代谢关键酶的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 低剂量环境激素对鲫鱼血清激素的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 低剂量环境激素对鲫鱼血清性激素浓度的影响
• 4.2.2 低剂量环境激素对鲫鱼甲状腺激素浓度的影响
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 低剂量环境激素对鲫鱼卵黄蛋白原的诱导
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 血浆中VTG 的分离提纯
• 5.2.2 鲫鱼VTG 分子量的测定
• 5.2.3 抗体和包被抗原的最佳工作浓度
• 5.2.4 标准曲线
• 5.2.5 农药环境激素对鲫鱼VTG 水平的影响
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 低剂量环境激素对鲫鱼基因组DNA 多态性影响的RAPD 分析
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 鲫鱼基因组DNA 的提取
• 6.2.2 低剂量甲草胺暴露对鲫鱼基因组DNA 多态性的影响
• 6.2.3 低剂量阿特拉津暴露对鲫鱼基因组DNA 多态性的影响
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 农药类环境激素对鲫鱼淋巴细胞活性功能的影响
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼淋巴细胞体外生长活性的影响
• 7.2.2 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼淋巴细胞增殖的影响
• 7.2.3 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼淋巴细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 农药类环境激素对鲫鱼巨噬细胞活性功能的影响
• 8.1 材料与方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼巨噬细胞体外生长活性的影响
• 8.2.2 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼巨噬细胞产生超氧阴离子（02-）活性的影响
• 8.2.3 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼巨噬细胞酸性磷酸酶（ACP）活性的影响
• 8.2.4 甲草胺和阿特拉津对鲫鱼巨噬细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 第九章 低剂量环境激素对鲫鱼的免疫毒性研究
• 9.1 材料与方法
• 9.2 结果与分析
• 9.2.1 低剂量甲草胺和阿特拉津暴露对鲫鱼淋巴细胞增殖的影响
• 9.2.2 低剂量甲草胺和阿特拉津暴露对鲫鱼血液白细胞数的影响
• 9.3 讨论
• 9.4 小结
• 第十章 总结与展望
• 10.1 研究结论
• 10.2 创新点
• 10.3 展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 攻读博士学位期间参与的科研项目
• 致谢