南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物活性与致病性研究

论文摘要

“南方鲇溃疡综合症”是近年来南方鲇养殖中出现的一种急性致死性的细菌性传染病。该病具有流行广、发病快、死亡率高等特点,以体表溃疡、肝、脾、肾肿大,腹水和胃肠道充血、出血为主要特征。该病给我国南方鲇养殖业造成了严重的经济损失。本试验对南方鲇源豚鼠气单胞菌的胞外产物（extracellular products,ECP）的活性和致病性进行研究,并分离纯化得到一种分子量为32.2KD的溶血素,确定其为豚鼠气单胞菌的致病因子,以上研究为阐明该病的致病机理提供理论依据。具体试验方法及结果如下:（1）采用琼脂扩散法测定了南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性和溶血活性,同时采用微量板法对胞外产物的细胞毒性进行了研究。结果显示:南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物具有蛋白酶、脂酶、明胶酶和脲酶活性,同时具有很强的溶血活性和细胞毒性。（2）豚鼠气单胞菌胞外产物腹腔注射小白鼠,结果显示:豚鼠气单胞菌胞外产物对小白鼠具有明显的致病性,其LD50为1.70mg/kg体重。实验小鼠主要表现为呼吸困难,食欲减退;肝肿大;肺淤血,肠道扩张、壁变薄,肠腔内充有大量气体和黄色黏液。病理组织学上,心脏肌纤维变性,横纹消失,肌间毛细血管扩张充血、出血,部分肌浆凝固,红染;肝细胞空泡变性、坏死;肾间质增宽,炎性水肿,细胞离散,大量单核细胞、中性白细胞等炎性细胞渗出,肾小血管严重瘀血,肾小球充血;脾出血,淋巴细胞数量明显减少;肺微静脉扩张淤血,肺泡腔内充斥大量红细胞;肠绒毛坏死脱落;胃上皮变性、坏死,脱落,粘膜下层水肿,病变严重的病例可见固有膜、粘膜下层坏死。（3）豚鼠气单胞菌胞外产物肌肉注射南方鲇,结果显示:豚鼠气单胞菌胞外产物对南方鲇具有明显的致病性,其LD50为0.802mg/kg。试验鱼主要表现为体表溃疡、腹水;肝、脾、肾肿大,充血,出血;胃积液,胃表面充血;肠腔内充有大量黄色粘液。病理组织学上表现骨骼肌和心肌坏死断裂,炎症细胞浸润;肝脏严重的空泡变性;肾小管上皮细胞变性、坏死、间质间大量炎症细胞浸润;脾充血出血,淋巴细胞减少;胃肠粘膜上皮细胞变性坏死脱落。细胞病理学上,病鱼主要器官的细胞均有较为严重的损伤,细胞肿胀,超微结构破坏。具体表现为肌纤维坏死,明暗带模糊不清;肝细胞内出现大量空泡,线粒体肿胀,染色质聚集边移;脾淋巴细胞染色质溶解消失,线粒体肿胀;肾脏内大量的白细胞浸润,上皮细胞坏死。血液病理变化表现为注射后24小时和48小时,RBC和Hb含量显著减少,WBC增加,红细胞脆性增加,血清中的AST、ALT、LDH活性显著升高和Cr含量也显著升高。（4）采用硫酸铵盐析,DEAE-Sephadex A50凝胶层析法从豚鼠气单胞菌胞外产物中提纯了一种分子量为32.2KDa的单一多肽溶血素。该溶血活性强,溶血价为25,对南方鲇有致病性,其LD50为0.29 mg/kg体重。注射后的南方鲇表现为腹部膨大、腹水,肝、脾、肾肿大,淤血、出血;胃肠道内充有大量粘液,粘膜充血、出血。组织病理学表现为骨骼肌水肿,变性,肌浆红染,甚至肌纤维坏死,溶解、断裂;肝细胞变性、坏死,血窦扩张淤血;肾小管上皮细胞变性、坏死,病变严重的整个肾小管的结构完全消失,间质造血拟淋巴细胞减少,大量巨噬细胞浸润;脾充充血,出血,淋巴细胞坏死,数量减少;胃肠到粘膜上皮变性、坏死,脱落。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 豚鼠气单胞菌研究现状
• 1.1.1 豚鼠气单胞菌的分类地位
• 1.1.2 豚鼠气单胞菌的生物学特性
• 1.1.3 豚鼠气单胞菌的致病性
• 1.2 胞外产物研究
• 1.2.1 胞外酶
• 1.2.2 外毒素
• 1.2.3 胞外产物的检测技术的研究进展
• 2. 本研究的目的和意义
• 3. 试验材料
• 3.1 试验菌株
• 3.2 试验动物
• 3.3 主要培养基
• 3.4 主要试剂
• 3.5 主要仪器
• 4. 试验方法
• 4.1 菌种的复苏和培养
• 4.2 胞外产物的制备
• 4.3 胞外酶活性检测
• 4.3.1 蛋白酶活性检测
• 4.3.2 脂酶活性检测
• 4.3.3 淀粉酶活性检测
• 4.3.4 卵磷脂酶活性检测
• 4.3.5 脲酶活性检侧
• 4.3.6 明胶酶活性检测
• 4.4 溶血性检测
• 4.5 细胞毒性检测
• 4.5.1 细胞培养
• 4.5.2 细胞毒性试验
• 4.6 胞外产物蛋白质含量测定
• 4.7 胞外产物对小鼠的致病性试验
• 4.7.1 试验分组
• 4.7.2 剖解变化
• 4.7.3 组织学观察
• 4.8 胞外产物对南方鲇致病性试验
• 4.8.1 饲养管理
• 4.8.2 试验分组
• 4.8.3 眼观病变观察
• 4.8.4 病理组织学观察
• 4.8.5 超微病理学观察
• 4.9 血液学分析
• 4.9.1 血样采集
• 4.9.2 血红蛋白测定
• 4.9.3 红细胞计数
• 4.9.4 白细胞计数
• 4.9.5 红细胞脆性检测
• 4.9.6 血液生化指标测定
• 4.9.7 数据分析
• 4.10 胞外产物溶血素的分离纯化
• 4.10.1 硫酸铵盐析
• 4.10.2 DEAE-Sephadex A50离子交换层析
• 4.10.3 溶血价的测定
• 4.10.4 分子量测定
• 4.10.5 溶血素蛋白含量测定
• 4.10.6 溶血素对南方鲇致病性试验
• 5. 结果与分析
• 5.1 胞外产物酶活性
• 5.2 胞外产物溶血活性
• 5.3 细胞毒性
• 5.4 胞外产物总蛋白含量
• 5.5 胞外产物对小鼠的致病性试验
• 5.5.1 临床症状观察
• 5.5.2 组织病理学变化
• 5.6 胞外产物对南方鲇致病性试验
• 5.6.1 临床症状观察
• 5.6.2 组织病理学变化
• 5.6.3 超微病理变化
• 5.7 血液学分析
• 5.8 溶血素的初步分离与提纯
• 5.9 溶血素的分子量
• 5.10 溶血素蛋白含量测定
• 5.11 溶血素对南方鲇的致病性
• 6. 讨论
• 6.1 豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性与致病机制探讨
• 6.2 豚鼠气单胞菌胞外产物感染小白鼠和南方鲇病理变化意义
• 6.3 豚鼠气单胞菌胞外产物感染南方鲇血液生理生化变化意义
• 6.4 南方鲇源豚鼠气单胞菌溶血素及其致病性
• 7. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 版图
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文