微流控芯片法检测单细胞水平SNP及苯乙烯易感性生物标志物的研究

论文摘要

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）研究是目前人类基因组研究的一个热点,如果得出某些SNP或某些SNP的特定组合与某些疾病、地区发病人群乃至个别患者有明显相关性,疾病的预防和治疗将可以更有针对性,甚至做到个体化。因此,SNP的开发对于目前医学领域的研究具有极大的潜力,而建立高度自动化和高通量的SNP检测分析技术也就具有十分重要的意义。虽然大多数传统SNP检测方法都有检测速度较慢或操作步骤复杂的缺点,但随着生物化学的迅速发展,许多新兴的高通量SNP检测技术在近年来应运而生,并且得到不断的发展。其中,起源于分析化学领域的微流控芯片技术在近年来发展迅猛并开始在医学领域发挥重要作用。微流控芯片技术不仅可以提高分析速度、增加分析效率、大大降低样品和试剂消耗,而且可使分析过程自动化、排除人为干扰、防止污染以及完成自动高效的重复实验。SNP的研究在职业病预防方面的应用已显示出了广阔的前景,从分子水平探讨毒物作用机制,对因某基因缺失或突变而导致对某些工业毒物易感的个体进行基因预防,可用于高危人群的筛检和监测及毒物危险度评价,有助于发展新的疾病预防策略等。因此,SNP可以作为易感性生物标志物（biomarker of susceptibility）,用来反映机体先天或后天获得的对接触外源性物质的反应能力。苯乙烯是工作场所中常见的化合物,在体内的代谢过程与其在体内增毒、解毒过程密切相关。研究发现,苯乙烯在体内经生物转化排出体外的代谢过程由多种生物代谢酶参与,代谢酶的催化活性受其基因多态性的调控,因此这些酶的基因多态性在很大程度上影响到苯乙烯在体内的代谢,从而影响其对机体的毒性损害作用。【研究目的】1.以微流控芯片为检测平台,建立在单细胞水平检测单核苷酸多态性的方法,并对影响单细胞二重巢式聚合酶链反应的因素进行初步探讨。2.探讨代谢酶基因多态性与苯乙烯代谢的关系,探寻苯乙烯职业危害的易感性生物标志物,为职业暴露人群的筛选、高危人群的健康监护提供理论依据,从而达到进一步加强病因预防的目的。【研究方法】1.抽取健康成人静脉血分离单个淋巴细胞,分别采用不同的细胞裂解方法制备单细胞DNA模板,然后应用巢式聚合酶链反应扩增CYP2B6基因目标片段,利用微流控芯片检测基因型,以常规的琼脂糖凝胶电泳技术对检测结果进行验证,并比较两种检测方法的检测速度和灵敏度。2.选择职业接触苯乙烯工人为研究对象,以微流控芯片为检测平台,检测CYP2B6,CYP2D6,GSTP1和NAT2的位点多态性,统计分析四种生物代谢酶不同基因型对苯乙烯代谢的影响,筛选出遗传易感基因。【研究结果】1.实验结果表明,酶裂法制备单细胞DNA模板效率最高,NPCR-微流控芯片方法基因分型结果与普通PCR-琼脂糖凝胶电泳方法完全一致,且基于微流控芯片的检测方法比琼脂糖凝胶电泳方法灵敏度更高,所需样品量更少,所需时间时间仅为其1/4,并且能自动对DNA片段进行定性、定量分析,是一种高效、低耗、灵敏、快速、重复性好的检测技术。2.以58名苯乙烯接触者外周血为样本,测定四种生物代谢酶基因型,结果发现:在高暴露组中, CYP2B6（exon4,G516T）野生基因型尿中苯乙烯的代谢产物含量高于突变基因型受试工人,具有显著性差异（P<0.05）;GSTP1（exon5,A105G）野生型和突变型尿中PHEMA含量水平具有显著性差异（P<0.05）;而不论在高暴露组还是低暴露组中,不同CYP2D6（exon1,C188T）和NAT2（exon5,C481T）基因型个体苯乙烯代谢产物含量无显著性差异（P>0.05）。【研究结论】1.应用单细胞PCR-微流控芯片技术可有效地对单细胞水平SNP位点进行基因分型,是一种快速、高效、低耗且结果可靠的方法。2.在携带CYP2B6和GSTP1不同基因型的研究对象中,尿中苯乙烯代谢产物含量差异具有显著性,因此,建议CYP2B6和GSTP1作为苯乙烯遗传易感性标志物,用于苯乙烯职业禁忌症的筛选。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 微流控芯片法检测单细胞水平SNP 的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二部分 苯乙烯易感性生物标志物的研究
• 1 对象与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 结语
• 1 本研究的结论
• 2 本研究的创新点
• 3 研究意义
• 参考文献
• [综述]
• 攻读硕士学位期间已（待）发表文章
• 致谢