论文摘要
研究背景慢性肾脏疾病（CKD）日益成为全球性的公共健康问题,尽管肾脏替代疗法（RRT）在CKD的治疗方面取得了很大的进展,但接受透析患者的死亡率仍高达21%～23%,肾脏移植则因为供肾来源不足,配型困难,治疗费用高,移植后排异反应未能彻底控制等原因不能广泛应用于临床。CKD的发病机制是进行性间质纤维化,细胞外基质（ECM）过渡积聚是纤维化的主要病理改变,因此逆转间质纤维化是治疗所有CKD的共同途径。基因治疗器官组织纤维化已成为慢性疾病治疗领域中的研究热点,应用uPA基因治疗肝脏纤维化和肝硬化以及肺纤维化在国内外均有许多尝试,但单一应用uPA治疗器官纤维化,效果并不十分显著。肾纤维化不只是单纯的ECM沉积,重要的是ECM破坏了临近的细胞结构,导致肾单位的减少。即使uPA降解了ECM,如果没有足够的再生细胞重建有功能的肾单位,也不一定能改善肾功能。故只有在细胞死亡之前逆转纤维化,或同时重建完整的、有功能的肾单位,才能在临床上取得一定的疗效。由于干细胞具有自我更新和分化能力,近几年,应用干细胞移植治疗肾脏疾病已成为该领域的另一研究热点。胚胎后肾间充质（MM）含有胚胎肾干细胞,其具有定向发育的潜能,在适当的诱导条件下,后肾间充质细胞可以分化为肾单位。该类细胞可生长成肾脏样器官,具有正常肾脏的结构和超微结构,在光镜或电镜下,由MM形成的成熟肾单位和集合管与正常肾脏无区别。目前尚未见后肾间充质细胞对慢性肾脏疾病是否有修复作用的报道。对于CKD,由于肾间质纤维化占据了细胞再生的空间,干细胞即使能归巢到病变部位,其分化、再生能力可能会受到限制。因此我们设想将胚胎后肾间充质细胞作为基因载体细胞增强局部uPA的表达,从而降解ECM,为更多的胚胎后肾间充质细胞归巢提供空间,从而促进肾功能的恢复。为此,我们:①将胚胎后肾间充质细胞移植治疗单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型,观察其是否对肾脏有保护作用;②将uPA基因导入胚胎后肾间充质细胞,利用干细胞归巢的特性,将基因靶向损伤部位,以期分泌uPA,降解ECM,同时修复损伤的肾脏细胞或再生为肾脏细胞;③观察肾功能、肾脏纤维化相关因子的变化,追踪胚胎后肾间充质细胞归巢情况,并对其保护机制做一探索性研究。将细胞治疗和基因治疗相结合,旨在探求阻止慢性肾脏疾病进展的新方法。目的研究胚胎后肾间充质细胞和转染uPA基因的胚胎后肾间充质细胞移植对单侧输尿管梗阻大鼠损伤肾脏的再生修复作用及其可能机制。方法1.构建并包装尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogenactivator,uPA）基因重组GFP-腺相关病毒重组质粒（pAAVhrGFP-uPA）。（1）用RT-PCR方法从幼鼠肾脏总RNA中扩增出uPA cDNA片段,在T4DNA连接酶的作用下,构建uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒（pAAV-hrGFP-uPA）。（2）重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定和DNA序列分析。（3）采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-hrGFP-uPA和辅助质粒pAAV-RC、pHelper以及pAAV-IRES-hrGFP、pAAV-RC和pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有感染性的病毒颗粒:rAAV病毒颗粒和AAV病毒颗粒。（4）用点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度。（5）病毒颗粒再转染AAV-293细胞以测定其感染能力。2.体外将大鼠胚胎后肾间充质细胞株（RIMM-18细胞）转染rAAV和AAV病毒颗粒,并通过绿色荧光蛋白（GFP）观察细胞的病毒转染率。（1）体外培养的RIMM-18细胞转染rAAV和AAV病毒颗粒,MOI=1×105。（2）在倒置荧光显微镜下观察48h的RIMM-18细胞的GFP表达,据此计算病毒转染率。（3）转染后的RIMM细胞进行传代。（4）转染后的RIMM-18细胞通过细胞HE染色、Giemsa染色和波形蛋白、角蛋白免疫组化染色对RIMM-18细胞进行生物学鉴定。（5）RT-PCR和Westernblot-ting技术对转染后的RIMM-18细胞进行检测。3.研究RIMM-18细胞和转染uPA基因的RIMM-18细胞通过尾静脉注射对UUO大鼠模型的再生修复作用,并探讨其作用机制。（1）雌性3月龄SD大鼠200只建立UUO模型,随机分为模型组（40只）,培基组（40只）,rAAV细胞组（40只）,AAV细胞组（40只）,细胞组（40只）。UUO模型建立的同时除模型组不做其他处理外,其它四组分别通过尾静脉注射无血清培养基,rAAV转染的RIMM-18细胞、AAV转染的RIMM-18细胞、未转染的RIMM-18细胞。（2）术后7d、14d、21d、28d收集尿液和血液用于检测24h尿蛋白、血肌酐、尿素氮、白蛋白和内生肌酐清除率,收集肾组织用于免疫组化、Western blotting、实时定量PCR等方法检测uPA、PAI-1、TGF-β1蛋白和基因。（3）术后1.5d、3d、7d、14d、21d、28d收集rAAV细胞组和MV细胞组大鼠梗阻侧肾脏、对侧肾脏、肝脏、脾脏、心肌和外周血涂片,在倒置荧光显微镜下观察各组织GFP的表达。结果1.（1）通过RT-PCR方法从大鼠肾脏总RNA中扩增出的uPA cDNA与所需的大小一致。（2）成功地构建uPA基因重组GFP—腺相关病毒载体质粒。（3）质粒经AAV-293细胞包装后成为具有传染性的病毒颗粒,点杂交法测定rAAV病毒颗粒的滴度为1.12×1012vg/mL,AAV病毒颗粒的滴度为1.0×1012vg/mL。（4）当MOI=1×105 vg/mL时,rAAV病毒颗粒再转染AAV-293细胞后48h的荧光率为80%,AAV病毒颗粒再转染AAV-293细胞后48h的荧光率为95%。2.（1）rAAV和AAV病毒颗粒对RIMM-18细胞进行转染,转染率为60%。（2）转染后的RIMM细胞进行传代,随着传代次数的增加GFP表达减弱。（3）转染的RIMM-18阳性细胞仍保持其原有特性:波形蛋白阳性,角蛋白阴性。（4）RT-PCR技术检测到rAAV转染的RIMM-18有uPA基因,而AAV转染的RIMM-18没有uPA基因。（5）Westernblotting技术没有检测到转染后的RIMM-18细胞有uPA表达。3.（1）14d、21d、28d rAAV细胞组、AAV细胞组和细胞组较模型组和培基组肾间质损害明显降低。（2）各组各时间点24h尿蛋白定量、白蛋白、血尿素氮、内生肌酐清除率无显著差异。且14d、28d时,rAAV细胞组、AAV细胞组和细胞组血肌酐明显少于模型组和培基组。（3）免疫组化染色显示rAAV细胞组、AAV细胞组和细胞组uPA半定量评分较模型组和培基组增高,PAI-1、TGF-β1半定量评分较模型组和培基组降低。（4）实时定量PCR检测rAAV细胞组uPA基因较模型组、培基组、AAV细胞组和细胞组增多,且各时间点rAAV细胞组uPA基因无显著性差异。实时定量PCR检测rAAV细胞组、AAV细胞组和细胞组较模型组和培基组PAI-1、TGF-β1基因少。（5）Western blotting检测rAAV细胞组、AAV细胞组和细胞组较模型组和培基组uPA蛋白明显增高,PAI-1和TGF-β1蛋白明显降低。（6）rAAV细胞组和AAV细胞组大鼠1.5d、3d、7d、14d、21d、28d时均可见梗阻侧肾组织有GFP表达;对侧肾组织也有GFP表达。1.5d、3d时可见肝脏、脾脏有GFP表达,7d、14d、21d、28d时肝脏、脾脏GFP表达明显减弱。各时间点心肌组织、外周血涂片未见GFP表达。结论1.包含uPA基因的GFP-腺相关病毒重组质粒已成功构建并包装成具有感染性的病毒颗粒。2.rAAV和AAV病毒颗粒对RIMM-18细胞的转染率高,达60%,腺相关病毒载体可介导uPA基因转染。3.（1）RIMM-18细胞通过尾静脉移植能改善UUO大鼠肾功能,减轻纤维化。（2）转基因的uPA基因无表达,AAV载体本身对细胞无影响。（3）通过GFP的表达可以观察到转染rAAV和AAV病毒颗粒的RIMM-18细胞进入损伤肾脏,主要分布在肾小管,参与损伤肾脏的修复。（4）对侧肾脏和肝脏、脾脏均有GFP阳性细胞,心肌和外周血涂片未发现GFP阳性细胞。（5）实验观察到4W,同种异体移植RIMM-18细胞没有发生免疫排斥反应和新生物。
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- [1].血清uPA水平在卵巢上皮性癌化疗患者中的变化及临床意义[J]. 中外医学研究 2020(17)
- [2].新辅助化疗治疗乳腺癌的疗效及其与uPA、PAI-1组织表达的相关性分析[J]. 解放军预防医学杂志 2016(06)
- [3].补肾化瘀解毒方对中晚期非小细胞肺癌化疗患者uPA及PAI-1的影响[J]. 中华中医药杂志 2016(01)
- [4].卵巢上皮性癌患者化疗前后血清uPA含量的变化及其对预后的影响[J]. 实用临床医药杂志 2016(03)
- [5].uPA蛋白、mRNA在子宫内膜异位症中的表达及意义[J]. 宁夏医学杂志 2015(09)
- [6].upa与limk1在胃癌中的研究进展[J]. 人人健康 2017(02)
- [7].Ⅰ型子宫内膜癌中uPA蛋白与雌激素受体的表达及相关性研究[J]. 河北医药 2015(11)
- [8].宫颈癌新辅助化疗前后uPA、VEGF和Ki-67的表达及其临床意义[J]. 华中科技大学学报(医学版) 2013(06)
- [9].uPA和VEGF在子宫内膜癌中的表达及临床意义[J]. 大连医科大学学报 2012(02)
- [10].尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其抑制物-1(PAI-1)在子宫内膜癌中的表达及其临床病理意义[J]. 中国妇幼保健 2012(18)
- [11].VEGF、EGFR和UPA在乳腺癌表达的意义及其相关性[J]. 中国老年学杂志 2010(23)
- [12].卵巢恶性肿瘤组织中uPA及其PAI-1表达的临床意义[J]. 广西医科大学学报 2008(05)
- [13].uPA和MMP-9在膀胱移行细胞癌癌组织中的表达及意义[J]. 山东医药 2008(08)
- [14].uPA、PAI-1表达与乳腺癌及预后的相关性分析[J]. 解放军预防医学杂志 2016(04)
- [15].uPA、PAI-1蛋白在大肠癌中的表达及其与预后的关系[J]. 昆明医科大学学报 2014(05)
- [16].uPA和HIF-1α在乳腺浸润性导管癌中的表达及其相关性[J]. 现代肿瘤医学 2012(01)
- [17].MMP-9、uPA及CD34与胃癌侵袭和转移及其相关性[J]. 现代肿瘤医学 2011(08)
- [18].上皮性卵巢癌患者化疗前后血清uPA含量变化及其对预后的影响[J]. 同济大学学报(医学版) 2015(04)
- [19].波立维联合拜阿司匹林治疗不稳定型心绞痛(UPA)的疗效和安全性[J]. 中国卫生产业 2012(36)
- [20].UPA及CD34与胃癌侵袭和转移的关系及其相关性研究[J]. 临床外科杂志 2008(06)
- [21].保留肾单位手术治疗肾肿瘤的疗效及对患者血清皮质醇、uPA、VEGF和T细胞亚群的影响[J]. 微创泌尿外科杂志 2020(01)
- [22].知柏地黄丸对解脲脲原体感染不育患者uPA的影响[J]. 中国中西医结合杂志 2014(12)
- [23].uPA在大肠癌中的表达及意义[J]. 现代肿瘤医学 2011(07)
- [24].uPA和MMP-9在胃癌组织中的表达及意义[J]. 中国现代医药杂志 2010(01)
- [25].VEGF,β-连环素及uPA在子宫内膜癌中的表达及意义[J]. 国际妇产科学杂志 2008(04)
- [26].uPA系统对乳腺癌的影响及在预后与治疗方面的研究进展[J]. 现代肿瘤医学 2010(05)
- [27].蝉花菌丝对单侧输尿管结扎大鼠肾间质uPA、PAI-1蛋白及mRNA表达的影响[J]. 中国中西医结合肾病杂志 2012(03)
- [28].MMPs、uPA与非何杰金淋巴瘤侵袭转移关系的研究进展[J]. 牡丹江医学院学报 2008(05)
- [29].血清uPA蛋白水平与急性髓系白血病的预后有关[J]. 第三军医大学学报 2016(12)
- [30].阿米洛利对高转移肺癌细胞侵袭能力和uPA系统的影响[J]. 中国肿瘤临床 2010(05)
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