生防真菌盾壳霉与植物病原真菌核盘菌及灰葡萄孢相互作用初步研究

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是植物病原真菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的重寄生真菌,却不能寄生与核盘菌亲缘关系很近的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。本文以盾壳霉-核盘菌和盾壳霉-灰葡萄孢的互作体系为模型,对互作过程中的生物学性状和mRNA表达谱进行了研究,并根据研究结果筛选出CMA11172基因,并进行了基因功能的初步验证,研究结果如下：通过对峙培养、菌核寄生等生物学实验证明了盾壳霉能够寄生核盘菌的菌丝和菌核,并可在后期产生分生孢子,但不能寄生灰葡萄孢的菌丝和菌核；核盘菌的菌丝和菌核能刺激盾壳霉分生孢子萌发,而灰葡萄孢的菌丝和菌核则不能；盾壳霉能在灭活的灰葡萄孢菌核上生长并产生分生孢子,而且其分生孢子产量大于在核盘菌灭活和未灭活的菌核上生长时的产量。通过Solexa测序技术获得了盾壳霉-核盘菌和盾壳霉-灰葡萄孢互作过程中的mRNA表达谱,每种真菌能够检测到的差异表达基因数均超过1000个。进一步通过RT-PCR技术对表达谱进行了验证,并从中筛选出盾壳霉CMA11172基因,该基因受核盘菌诱导表达增强,而不受灰葡萄孢诱导；核盘菌和灰葡萄孢的同源基因SS1G10985和BC1G11347均受盾壳霉诱导表达增强,但SS1G10985增强倍数高；SS1G03247和BC1G06796均被盾壳霉抑制,但SS1G03247初始阶段便被抑制,BC1G06796互作12h才被抑制。构建了盾壳霉CMA11172基因的超量表达载体pC11172OE,并利用农杆菌介导转化技术（ATMT）转化盾壳霉ZS-1,获得了38个转化子,通过PCR和RT-PCR进一步对部分转化子进行了潮霉素抗性基因验证和基因表达水平验证,获得5个超表达转化子。对5个转化子的生物学性状进行了研究,发现超表达转化子与出发菌株ZS-1相比,菌丝近尖端处分枝较多,产生抗细菌物质能力较强,不能寄生灰葡萄孢,且对核盘菌的寄生能力未能增强。部分转化子的生长速度显著下降,能够延迟与灰葡萄孢菌落之间黄色坏死带的产生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌及其生防菌盾壳霉
• 1.1 核盘菌和作物菌核病
• 1.2 盾壳霉的生防潜力研究
• 2 核盘菌与盾壳霉互作的研究进展
• 2.1 寄主与寄生物互作
• 2.2 核盘菌与盾壳霉的互作
• 3 灰葡萄孢
• 4 Seloxa方法简介
• 5 选题目的和意义
• 第二章 生防真菌盾壳霉与植物病原真菌核盘菌及灰葡萄孢互作的生物学性状研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株的活化
• 1.2.2 菌核的获得
• 1.2.3 盾壳霉与核盘菌及灰葡萄孢的对峙培养
• 1.2.4 核盘菌和灰葡萄孢菌丝对盾壳霉分生孢子的刺激作用检测
• 1.2.5 核盘菌和灰葡萄孢菌核浸出液对盾壳霉分生孢子的刺激作用
• 1.2.6 盾壳霉对核盘菌及灰葡萄孢菌丝的选择寄生
• 1.2.7 盾壳霉对核盘菌及灰葡萄孢菌核的选择寄生
• 1.2.8 盾壳霉以不同菌丝作为营养物质的利用
• 1.2.9 盾壳霉以不同菌核作为营养物质的利用
• 1.2.10 核盘菌及灰葡萄孢产酸情况比较
• 2. 实验结果
• 2.1 盾壳霉与核盘菌及灰葡萄孢的对峙培养
• 2.2 核盘菌和灰葡萄孢菌丝对盾壳霉分生孢子萌发的刺激作用
• 2.3 核盘菌和灰葡萄孢菌核浸出液对盾壳霉分生孢子萌发的刺激作用
• 2.4 盾壳霉对核盘菌及灰葡萄孢菌丝的选择寄生
• 2.5 盾壳霉对核盘菌及灰葡萄孢菌核的选择寄生
• 2.6 盾壳霉以不同菌丝为营养的生长情况
• 2.7 盾壳霉以不同菌核为营养的生长情况
• 2.8 核盘菌和灰葡萄孢产酸量的比较
• 3. 结论与讨论
• 第三章 盾壳霉与核盘菌及灰葡萄孢互作过程mRNA表达谱检测及其验证
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株及培养基
• 1.1.2 实验所需试剂及试剂盒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 盾壳霉分生孢子的获得
• 1.2.2 核盘菌、灰葡萄孢及盾壳霉菌丝的准备
• 1.2.3 核盘菌、灰葡萄孢与盾壳霉混合总RNA的提取
• 1.2.4 核盘菌、灰葡萄孢与盾壳霉互作的mRNA表达谱的获得
• 1.2.5 差异表达基因的RT-PCR验证
• 2 实验结果
• 2.1 盾壳霉与核盘菌及灰葡萄孢互作过程mRNA表达谱的获得
• 2.1.1 核盘菌Ep-1PNA367与盾壳霉ZS-1互作过程表达谱数据
• 2.1.2 灰葡萄孢CanBC-3V与盾壳霉ZS-1互作过程表达谱数据
• 2.1.3 盾壳霉ZS-1与核盘菌Ep-1PNA367互作过程表达谱数据
• 2.1.4 盾壳霉ZS-1与灰葡萄孢CanBC-3V互作过程表达谱数据
• 2.2 差异表达基因的RT-PCR验证
• 2.2.1 盾壳霉与核盘菌及灰葡萄孢互作过程差异表达基因的验证
• 2.2.2 核盘菌及灰葡萄孢与盾壳霉互作过程差异表达基因的验证
• 3 结论与讨论
• 第四章 盾壳霉CMA11172基因超表达载体的构建及超表达转化子生物学性状的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株及载体
• 1.1.2 培养基和试剂
• 1.1.3 抗生素
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 超表达载体的构建
• 1.2.2 重组质粒pC11172OE的验证
• 1.2.3 重组质粒pC11172OE转入农杆菌
• 1.2.4 农杆菌介导超表达载体转化盾壳霉菌株ZS-1
• 1.2.5 CMA11172超表达转化子PCR鉴定
• 1.2.6 CMA11172超表达转化子的RT-PCR鉴定
• 1.2.7 CMA11172超表达转化子生物学性状的研究
• 2 实验结果
• 2.1 超表达载体的构建和验证
• 2.1.1 利用引物OES和OEA扩增超表达片段
• 2.1.2 重组质粒pC11172OE的验证
• 2.1.3 农杆菌质粒的鉴定
• 2.1.4 超表达转化子的筛选及验证
• 2.1.5 CMA11172超表达转化子形态特征
• 2.1.6 CMA11172超表达转化子生长速度
• 2.1.7 CMA11172超表达转化子产生抗细菌物质能力的测定
• 2.1.8 CMA11172超表达转化子产生抗真菌物质能力的测定
• 2.1.9 CMA11172超表达转化子与核盘菌及灰葡萄孢对峙培养
• 3 结论与讨论
• 结论和展望
• 参考文献
• 致谢