论文摘要
中国卤虫（Artemia sinica）隶属于节肢动物门甲壳纲,除南极外在世界各大洲均有分布,在中国主要分布于沿海各省、市、自治区盐田以及内陆咸水湖中。和其他无脊椎动物一样,卤虫缺乏真正意义上的抗体、没有免疫记忆能力,只能依靠非特异性免疫反应来抵御病原体的侵染。其中,酚氧化酶（phenoloxidase,PO）通过产生黑色素在卤虫的免疫防御中起着决定性作用。查清卤虫PO的生化性质和酶性质,对于揭示卤虫等无脊椎动物的非特异性免疫途径及其机理具有重要的科学意义,对于利用免疫促进剂提高卤虫等无脊椎动物的非特异性免疫能力也具有重要的应用价值。中国卤虫作为甲壳动物中多种理论研究的模式动物,至今仍未见对其PO的分离纯化及其性质的研究报道。本文拟利用凝胶过滤和离子交换柱层析技术对中国卤虫PO进行分离纯化并对其生化性质与酶性质进行系统研究,旨在揭示中国卤虫PO的生化性质与酶性质,为进一步研究卤虫等甲壳动物的非特异性免疫及其免疫调控机理奠定基础。本文首先利用成体中国卤虫的组织匀浆、高速离心、硫酸氨沉淀和透析技术制备出PO粗品,其次先后利用Superdex 200凝胶过滤柱层析和Q sepharose Fast Flow离子交换柱层析对PO进行了分离纯化,并以L-二羟苯丙氨酸（L-DOPA）为底物对其酚氧化酶活性进行了鉴定。实验结果表明,所得中国卤虫PO纯化样品的纯度很高,在还原性和非还原性SDS-PAGE电泳中均为单一条带,其分子量约为125.5 kDa,上述纯化步骤的最终纯化倍率高达51.69倍。生化性质和酶性质研究结果表明,中国卤虫PO纯化样品对L-DOPA发挥酚氧化酶活性的最适pH值为7.0、最适反应温度为50℃,其特异性底物为L-DOPA和儿茶酚,且其对底物L-DOPA和儿茶酚的Km值分别为4.3 mmol/L和8.3 mmol/L。不同氧化酶抑制剂的研究结果发现,亚硫酸钠、抗坏血酸和柠檬酸几乎能完全抑制中国卤虫PO的酶活性,半胱氨酸、苯甲酸和苯硫脲能对其酶活性也有很强的抑制作用,而硫脲对其酶活性的抑制作用较弱;综合底物特异性和氧化酶抑制剂的实验结果,证明中国卤虫PO是一种属于儿茶酚酶类型的酚氧化酶。此外,金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）和二乙基二硫氨基甲酸酯（DETC）可浓度依赖性地抑制中国卤虫PO的酶活性;金属离子Mg2+和Zn2+均能显著抑制中国卤虫PO的酶活性,而Cu2+和Ca2+能显著增强中国卤虫PO的酶活性,说明中国卤虫PO很可能还是一种金属蛋白酶。PO酶活性的回复实验结果显示,被DETC抑制的PO活性可特异性地为15 mmol/L Cu2+所回复,证明中国卤虫PO是一种含铜的金属酶。综上所述,中国卤虫PO是一种属于儿茶酚酶类型的含铜金属蛋白酶。
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相关论文文献
- [1].中华卤虫(Artemia sinica)家系构建的几个关键技术[J]. 河北渔业 2020(12)
- [2].中国卤虫(Artemia sinica)早期胚胎发育相关基因表达序列标签(ESTs)分析[J]. 海洋与湖沼 2008(02)