异源因子诱导山羊IPS细胞

论文摘要

2006年,Takahashi和Yamanaka将四个诱导因子oct4、sox2、klf4和c-myc导入小鼠胚胎成纤维细胞,进而获得了类似于胚胎干细胞的多能干细胞,称之为“诱导多潜能干细胞”（iPS细胞）。由于iPS细胞在临床治疗中有着巨大的潜在应用价值,因此,有很多研究小组对iPS细胞进行了各方面的研究,如iPS细胞的安全性、iPS细胞的诱导效率、iPS细胞在模式动物或人类疾病中的临床应用及不同物种iPS细胞的诱导等。本试验以山羊为材料分离山羊耳尖成纤维细胞,并通过慢病毒将源自人类的oct4、sox2、klf4和c-myc四个诱导因子导入山羊耳尖成纤维细胞,在不同饲养层以及不同化学物质处理的条件下,尝试诱导得到山羊iPS细胞,初步建立山羊iPS细胞诱导的方法。结果如下：1.将慢病毒包装所需的包装载体pMD2.G、psPAX2及含有人oct4、sox2、klf4和c-myc四个诱导因子的慢病毒载体回收、转化、扩大培养后提取质粒,电泳检测及双酶切鉴定均可见预期大小的条带。2.采用胰蛋白酶消化法分离昆明小鼠胚胎成纤维细胞,采用组织块贴壁法分离山羊耳尖成纤维细胞,均成功分离到所需细胞,并能良好的培养、冻存及复苏。丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞、山羊耳尖成纤维细胞、猪胎儿成纤维细胞和山羊胎儿成纤维细胞,制备饲养层。3.培养293T细胞,通过脂质体2000共转染慢病毒载体及相应包装载体,进行慢病毒包装,收集慢病毒上清,提取慢病毒上清RNA并反转录得到cDNA,采用定量PCR测定慢病毒滴度。计算得到慢病毒滴度：oct4为8.025×105/ml; sox2为3.056×106/ml; klf4为2.952×106/ml; c-myc为4.965×106/ml。4.慢病毒感染山羊耳尖成纤维胞、猪胎儿成纤维细胞和山羊胎儿成纤维细胞,在不同饲养层、以及不同化学物质处理（维生素C、丙戊酸、维生素C加丙戊酸）条件下进行诱导培养。结果显示,只有山羊耳尖成纤维细胞饲养层条件下诱导得到iPS细胞,而不同化学物质处理对于iPS细胞的诱导没有起到明显效果。5.对得到的iPS细胞进行碱性磷酸酶染色及SSEA-1、oct4免疫细胞化学染色,发现iPS细胞表现碱性磷酸酶活性且SSEA-1、oct4免疫细胞化学染色结果呈阳性。6.提取iPS细胞RNA, RT-PCR检测几个外源因子及一些相关胚胎干细胞标记基因,发现iPS细胞表达全部四个外源因子及胚胎干细胞标记基因oct4和nanog,但不表达胚胎干细胞标记基因eras、daxl、gdf3。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩率词表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 iPS细胞产生和鉴定
• 2.1 iPS细胞的产生
• 2.1.1 安全性
• 2.1.2 诱导效率
• 2.2 iPS细胞的鉴定
• 2.2.1 细胞形态
• 2.2.2 自我更新能力
• 2.2.3 碱性磷酸酶活性
• 2.2.4 胚胎干细胞标记基因的表达
• 2.2.5 DNA微阵列分析
• 2.2.6 启动子甲基化状况分析
• 2.2.7 体外分化特性
• 2.2.8 畸胎瘤
• 3 iPS细胞的应用
• 3.1 iPS细胞的应用价值
• 3.2 临床疾病方面的研究
• 4 其它的一些研究成果
• 第二章 研究目的和意义
• 第三章 异源因子诱导山羊iPS细胞
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 溶液的配制
• 2 试验方法
• 2.1 质粒获取
• 2.1.1 质粒回收
• 2.1.2 质粒转化
• 2.1.3 质粒提取
• 2.1.4 质粒双酶切鉴定
• 2.2 细胞分离培养
• 2.2.1 MEF分离培养
• 2.2.2 山羊耳尖成纤维细胞（goat ear fibroblasts,GEF）分离培养
• 2.2.3 293T细胞培养、冻存和复苏
• 2.3 GEF核型分析
• 2.4 绘制GEF生长曲线
• 2.5 慢病毒包装
• 2.6 病毒滴度测定
• 2.6.1 病毒上清提取RNA
• 2.6.2 绝对定量PCR测定慢病毒滴度
• 2.7 慢病毒上清纯化
• 2.8 饲养层制备
• 2.9 慢病毒感染供体细胞
• 2.9.1 悬浮感染
• 2.9.2 贴壁感染
• 2.10 AKP染色
• 2.11 免疫细胞化学染色
• 2.12 iPS细胞和GEF RNA提取
• 2.13 外源因子扩增
• 2.14 内源ES细胞标记基因扩增
• 3 结果分析
• 3.1 质粒提取
• 3.2 质粒酶切鉴定
• 3.3 GEF和MEF分离培养
• 3.4 293T细胞培养
• 3.5 GEF核型分析
• 3.6 GEF生长曲线绘制
• 3.7 病毒滴度测定
• 3.8 慢病毒感染供体细胞
• 3.9 AKP染色
• 3.10 免疫细胞化学染色
• 3.11 外源因子扩增
• 3.12 内源ES细胞标记基因检测
• 4 讨论
• 4.1 载体
• 4.2 细胞分离、培养及传代等
• 4.3 慢病毒包装
• 4.4 慢病毒滴度测定
• 4.5 慢病毒感染
• 4.6 饲养层制备
• 4.7 不同饲养层对iPS诱导的影响
• 4.8 供体细胞
• 4.9 iPS细胞活力
• 4.10 诱导效果
• 4.11 AKP染色和免疫细胞化学染色
• 4.12 外源因子PCR扩增
• 4.13 内源ES细胞标记基因PCR扩增
• 小结
• 参考文献
• 致谢