用酵母双杂交系统筛选IBDV弱毒株VP2蛋白CEF受体的初步研究

论文摘要

传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官一法氏囊,导致免疫抑制。1957年本病首次在美国的特拉华州的甘布罗镇（Gumboro）的肉鸡群中发生,20世纪80年代美国又发现了变异株,欧洲国家首先报道有超强毒株（vvIBDV）出现,90年代初vvIBDV传至中国及亚洲其它国家和地区。IBD给养鸡业带来了巨大的经济损失。IBDV的分子生物学研究始于70年代,人们研究发现各IBDV毒株之间的基因变异主要集中在A节段的VP2区域,VP2是血清型特异性抗原,既是IBDV的主要结构蛋白,又是病毒的主要宿主保护性抗原,与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异、细胞凋亡等有关。随着对IBDV的深入研究,人们愈加认识到研究病毒感染机制等基础领域的重要性,其中病毒受体的研究占据着举足轻重的地位,在很多领域都展开广泛研究,尤其人医方面研究更为深入。目前关于IBDV受体蛋白研究的报道很少,虽然有一些相关报道,但仍处于研究病毒自身蛋白与蛋白之间作用的水平,有关病毒蛋白与宿主受体蛋白相互作用的研究还没有报到。酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种有效方法。该系统能迅速、灵敏地在真核细胞体内检测蛋白生理状态下的互作,并可快速获得目的蛋白的编码基因,近几年来已在很多领域得到应用。本研究利用酵母双杂交系统从CEF cDNA文库中筛选与IBDV弱毒VP2蛋白相互作用的受体蛋白编码基因,并对获得受体蛋白进行初步研究,为研究该病毒的致病机制,防制传染性法氏囊病奠定理论基础。本课题主要研究内容包括以下几方面:1.鸡胚成纤维细胞CDNA表达文库的构建利用gateway技术构建鸡胚成纤维细胞（CEF）文库,以5′端生物素标记的Oligo （dT） primer为引物反转录后连接Adapter,层析柱纯化,通过BP重组反应构建cDNA入门文库,其平均滴度为1.1×106cfu/mL,文库总容量为1.2×107cfu,平均插入片段为2243bp,重组率为100%。通过LR重组反应将入门文库转换为表达文库,经测定平均滴度为5×105cfu/mL,文库总容量为5.5×106cfu,平均插入片段为2411bp,重组率为100%。结果表明,所构建的文库具有较高的重组率和较大的库容量,可作为较高质量的文库来研究IBDV的相关基因,为筛选IBDV在CEF中的细胞受体,研究细胞嗜性提供基础平台。2.IBDV弱毒VP2诱饵载体构建及其自激活作用的检测通过BP和LR两个反应将IBDV Gt株VP2基因克隆到pDEST-32载体上构建诱饵载体,通过酶切和PCR鉴定,并测序正确后,用醋酸锂法转化酵母菌MaV203,在三缺陷板（SC-Trp-Leu-His）上观察其生长情况。结果确定了3AT使用浓度,且证明了诱饵载体本身无自激活活性,为下一步筛选文库提供正确的诱饵载体。3.从CEF文库筛选与IBDV Gt VP2蛋白相互作用受体蛋白及相互作用的验证用构建的诱饵质粒筛选CEF CDNA文库,采用顺序转化的方法,先将Bait质粒转入酵母MaV203中,挑取阳性克隆做酵母感受态细胞,然后再将文库质粒转入含Bait质粒酵母感受态细胞,通过X-gal实验和三种缺陷型培养基筛选,找出19个阳性克隆,提取质粒,测序并比对,结果获得大小两段序列（与原鸡序列相似度为99.9%）,分别为800bp和350bp。最后将两段序列构建成Prey质粒,用同筛库的方法反过来验证与Gt VP2的互作,结果证实了二者的相互作用。4.IBDV VP2蛋白CEF受体的初步研究突变掉CR211中间所含终止密码子,将其分别克隆到原核载体pET32a和真核表达载体pCAGGS上。经Amp+筛选、PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。获得重组质粒命名为pET32a-CR211和pCAGGS-CR211。将pET32a-CR211转化宿主菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下成功表达了约31kDa的融合蛋白;将构建的pCAGGS-CR211转染IBDV非允许细胞PK15,做间接免疫荧光实验,结果检测到较强的绿色荧光,说明二者在活体内存在相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 酵母双杂交系统
• 1.2 IBDV 及其细胞受体研究进展
• 1.3 本实验研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 病毒、细胞和实验动物
• 2.1.2 菌株、质粒和表达载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 鸡胚成纤维细胞cDNA 表达文库构建
• 2.2.2 IBDV 弱毒VP2 诱饵载体构建及其自激活作用检测
• 2.2.3 IBDV Gt VP2 受体蛋白筛选及相互作用验证
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡胚成纤维细胞cDNA 表达文库构建
• 3.1.1 鸡胚成纤维细胞总RNA 和纯化的mRNA 质量分析
• 3.1.2 鸡胚成纤维细胞cDNA 鉴定
• 3.1.3 鸡胚成纤维细胞cDNA 文库滴度测定
• 3.1.4 cDNA 入门文库与表达文库质量鉴定
• 3.1.5 cDNA 入门文库序列测定及生物信息学分析
• 3.2 IBDV 弱毒VP2 诱饵载体构建及其自激活作用检测
• 3.2.1 诱饵载体构建及鉴定
• 3.2.2 3AT 浓度测试
• 3.2.3 X-gal 报告基因测试
• 3.3 IBDV Gt VP2 受体蛋白筛选及相互作用验证
• 3.3.1 含诱饵质粒酵母菌鉴定
• 3.3.2 文库质粒转化含诱饵质粒酵母感受态细胞
• 3.3.3 X-gal 试验对相互作用阳性克隆的初步筛选
• 3.3.4 阳性克隆进一步筛选
• 3.3.5 从阳性克隆中剔除Bait 质粒
• 3.3.6 阳性克隆中所带文库质粒的鉴定及序列分析
• 3.3.7 构建Prey质粒并转化酵母感受态细胞
• 3.3.8 Bait 质粒转化含Prey 质粒酵母感受态细胞并验证二者互作
• 3.4 IBDV Gt VP2 蛋白CEF 受体初步研究
• 11 原核表达载体构建'>3.4.1 CR2₁₁原核表达载体构建
• 11 真核表达载体构建'>3.4.2 CR2₁₁真核表达载体构建
• 11 原核表达产物SDS-PAGE 电泳分析'>3.4.3 CR2₁₁ 原核表达产物SDS-PAGE 电泳分析
• 11 真核载体质粒转染PK15—受体重建实验'>3.4.4 CR2₁₁真核载体质粒转染PK15—受体重建实验
• 4 讨论
• 4.1 IBDV 受体研究的必要性
• 4.2 CEF cDNA 表达文库的构建
• 4.3 诱饵载体构建及自激活检测
• 4.4 文库的筛选
• 4.5 IBDV Gt VP2 蛋白 CEF 受体的初步研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文