辽宁碱蓬PEAMT基因克隆及功能分析

论文摘要

磷酸乙醇胺甲基转移酶（PEAMT）是合成磷酸胆碱的关键酶,磷酸胆碱脱磷酸后可形成胆碱,胆碱经两步连续反应合成甜菜碱。甜菜碱是一种小分子、非毒性的渗透调节物质,甜菜碱的积累不但能降低细胞渗透势,增强吸水能力,以维持细胞膨压,提高植物对逆境的适应能力,还能稳定酶、复合蛋白（如PSⅡ外周多肽）等生物大分子的结构与功能,保持膜的有序态,在细胞内起渗透保护作用。内源胆碱不足将影响甜菜碱的生物合成。克隆PEAMT基因,通过基因工程手段将该基因转入到植物中,提高转基因植物胆碱的含量,从而提高甜菜碱含量,对提高植物的抗盐能力有着非常重要的意义。本文克隆了辽宁碱蓬PEAMT基因,并将该基因转入到烟草中,对转基因烟草的胆碱及甜菜碱含量进行了分析。主要结果如下:1、用RT-PCR和RACE技术获得了辽宁碱蓬的PEAMT cDNA序列。PEAMT cDNA 1688 bp,5’端非编码区34 bp,3’端非编码区169 bp,开放阅读框架1485 bp个核苷酸,编码一个由495个氨基酸构成的多肽,与日本碱蓬、甜菜、菠菜、大洋洲滨藜等同科植物PEAMT的氨基酸序列相似性很高,分别为99.6 %,84.82 %,85.43 %,84.29 %。2、克隆了PEAMT基因的编码区,构建了其植物表达载体pBI121-PEAMT,冻融法将质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404,获得工程菌LBA4404-pBI121-PEAMT。3、农杆菌介导法将PEAMT基因导入烟草（Nictiana tabacum L.cv.89）,获得卡那霉素抗性植株,PCR检测获得转基因阳性植株。用化学比色法测定转基因植株中胆碱、甜菜碱含量,结果表明转基因烟草的胆碱、甜菜碱含量普遍高于对照。过量表达辽宁碱蓬PEAMT基因可以提高转基因植物中胆碱的含量,从而提高其甜菜碱含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 PEAMT
• 1.1.1 PEAMT 的性质
• 1.1.2 PEAMT 的结构
• 1.1.3 PEAMT 的功能
• 1.1.4 PEAMT 与逆境胁迫的关系
• 1.1.5 分子生物学与基因工程
• 1.2 植物基因克隆的方法
• 1.2.1 序列克隆
• 1.2.2 表型差异克隆
• 1.2.3 功能克隆
• 1.2.4 定位克隆
• 1.3 植物基因功能的研究方法
• 1.3.1 基因过表达
• 1.3.2 基因沉默
• 1.3.3 基因敲除
• 1.3.4 基因捕获技术
• 1.3.5 微阵列分析
• 1.3.6 生物信息学分析
• 1.3.7 新的晶体解析方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 本研究的主要内容
• 第二章 辽宁碱蓬 PEAMT 基因克隆及植物表达载体构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 辽宁碱蓬总RNA 的提取
• 2.2.2 PEAMT cDNA 全序列的获得
• 2.2.3 PEMAT 基因的克隆
• 2.2.4 PEAMT 基因植物表达载体的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA 的提取及其完整性
• 2.3.2 PEAMT cDNA 全序列获得
• 2.3.3 PEAMT 基因克隆
• 2.3.4 PEAMT 植物表达载体构建
• 2.4 讨论
• 2.4.1 PEAMT cDNA 的分离
• 2.4.2 PEAMT 基因同源性分析
• 2.5 小结
• 第三章 辽宁碱蓬 PEAMT 基因在烟草中的表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 工程菌的构建
• 3.2.2 农杆菌介导转化烟草
• 3.2.3 转基因植株的检测
• 3.2.4 甜菜碱、胆碱含量的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 工程菌的构建
• 3.3.2 农杆菌介导转化烟草
• 3.3.3 转基因烟草的检测
• 3.3.4 甜菜碱、胆碱含量的测定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 转基因植株的PCR 检测
• 3.4.2 PEAMT 基因在提高转基因烟草胆碱和甜菜碱含量中的作用
• 3.4.3 外源基因在转基因植物中的表达
• 3.5 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢