论文摘要
目的:观察低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）基因对大鼠局灶性脑缺血后内源性神经干细胞（neural stem cells, NSCs）的增殖、分化以及血管新生的影响,并探讨HIF-1α对内源性NSCs增殖、分化及血管新生的作用机制。方法:建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,1 d后将神经缺失功能评分在7-12分的大鼠随机分为生理盐水组（NS）、单纯腺病毒组（Ad）和低氧诱导因子-1α组（Ad-HIF-1α）。分别将NS、Ad和Ad-HIF-lα注射到模型鼠缺血侧侧脑室,BrdU标记内源性NSCs的增殖与分化。（1）于7 d、14 d、21 d、28 d进行神经缺失功能评分并比较。（2）注射后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d RT-PCR法检测HIF-1α、VEGF mRNA的表达,2 d、7 d免疫组化检测HIF-1α、VEGF的表达;免疫组化法观察3组大鼠局灶性脑缺血后缺血灶周围促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）的表达。（3）免疫荧光法计数再灌注不同时间点室管膜下区（the subventricular zone, SVZ）BrdU阳性细胞（3、7、14、21、28 d）和皮层BrdU/NF200、BrdU/GFAP（28 d）阳性双标细胞。（4）免疫组化检测Ⅷ因子治疗后28 d时的表达情况。结果: （1）Ad-HIF-1α组在第7、14、21、28 d神经缺失功能评分优于NS组和Ad组（P<0.05）。（2）与Ad相比Ad-HIF-1α增强了各时间点HIF-1α、VEGF及EPO的表达。（3）Ad-HIF-lα组BrdU标记细胞数明显增加;新生细胞分化结果显示:28 d时Ad-HIF-lα组BrdU/NF200（47.74%±13.52%）、BrdU/GFAP（67.83%±20.75%）,与其它组相比均有显著性差异（P<0.05）。（4） Ad-HIF-1α组Ⅷ因子阳性细胞数与其它两组比较有显著性差异（P<0.01）。结论:低氧诱导因子-1α基因可促进大鼠局灶性脑缺血后内源性NSCs的增殖与分化以及新生血管的形成,从而促进神经功能的恢复。目的:观察携带低氧诱导因子-1α的腺病毒感染神经干细胞后HIF-1α的表达以及对神经干细胞生物学特性的影响。方法:培养胎鼠脑皮层神经干细胞,利用携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和HIF-1α基因的重组腺病毒（adenovirus,Ad）转染NSCs,相差显微镜下观察NSCs的形态特征及在荧光显微镜下观察NSCs及其诱导分化后的细胞的GFP表达情况;Western blot检测HIF-1α在NSCs中的表达;应用免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白（Nestin）、神经微丝蛋白（neurofilament, NF）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibriliary acidic protein,GFAP）的表达;膜片钳观察分化后神经元钠电流的变化以及对缺氧的耐受情况。结果:（1）重组腺病毒HIF-1α转染NSCs后外源性基因及绿色荧光蛋白有持续稳定表达;（2） HIF-1α转染的NSCs形态学与未转染的NSCs无明显差异,HIF-1α转染促进NSCs增殖;（3）检测神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实转染后的NSCs同样具有多向分化潜能。（4） HIF-1α转染的NSCs分化后的神经元钠电流为（1053.7士127.4 pA）,与转染Ad（637.2士82.5 pA）以及未转染（597.3士73.5 pA）的比较差异有显著性意义（P<0.01）;HIF-1α转染的NSCs分化后的神经元对缺氧耐受的时间明显延长。结论:（1）携带HIF-1α基因的腺病毒在体外能成功地感染神经干细胞,并得到HIF-1α的表达。（2）HIF-1α的表达能够增强NSCs的增殖能力,增加NSCs分化的神经元样细胞钠电流及对缺氧的耐受能力。目的:观察局灶性脑缺血后HIF-1α基因修饰的NSCs移植对细胞存活、迁移以及血管新生的影响,探讨其机制。方法:建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,1 d后将神经缺失功能评分在7-12分的大鼠随机分为生理盐水组（NS）、Ad修饰的NSCs（NSCs-Ad）组和Ad-HIF-1α修饰NSCs（NSCs-HIF）组,分别给予生理盐水、NSCs-Ad和NSCs-HIF注射到模型鼠缺血侧侧脑室,注射前干细胞行BrdU标记3天。于7 d、14 d、21 d、28 d进行神经缺失功能评分并比较。免疫荧光双标检测NSCs-HIF在体内HIF-1α的表达,移植后5 w BrdU免疫荧光染色计数大鼠双侧皮层移植的神经干细胞数,检测Ⅷ因子的表达情况以及不同时间点各组Slit2的表达。结果: （1）NSCs-HIF组在第7 d、14 d、21 d、28 d神经缺失功能评分优于NS组和NSCs-Ad组（P<0.05）。（2）NSC-HIF在体内同样能够表达HIF-1α。（3）NSCs-HIF组缺血侧大鼠皮层神经干细胞数较NSCs-Ad组明显增加（P<0.01）。（4） NSCs-HIF组Ⅷ因子阳性细胞数与NS组和NSCs-Ad组比较差异有显著性意义（P<0.01）。（5）大鼠局灶性脑缺血可诱导同侧皮层神经细胞表达Slit2,应用NSCs-HIF后各时间点Slit2表达较其他两组明显增加。结论:低氧诱导因子-1α基因可促进NSCs的存活、迁移以及新生血管的形成,对大鼠局灶性脑缺血有一定的治疗作用。
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