玉米WRKY家族转录因子基因ZmWRKY33的克隆及功能分析

论文摘要

低温、干旱、高盐是影响植物生长和限制作物产量的主要非生物胁迫因素,因此研究植物在不良生长环境下的抗逆机制,并采取相应措施降低逆境对植物的损害,对提高作物产量具有十分重要的意义。在对植物逆境胁迫信号转导的研究中发现,转录因子是其中一个很关键的因素,它能将胁迫信号进行传递和放大,调控下游相关功能基因及调控基因的表达。转录因子根据DNA结合结构域的不同可以分为不同类型,其中WRKY家族转录因子在植物应答非生物胁迫中起着重要的作用,在胁迫环境下,WRKY转录因子能与抗逆基因启动子上游的W-box结合,从而特异性的调控抗逆基因在植物体内的表达,提高植物对抗胁迫的能力。本研究通过电子克隆技术获得了一个玉米中与抵抗非生物胁迫有关的转录因子基因ZmWRKY33,并通过RT-PCR克隆得到了该基因的开放阅读框序列。经序列分析显示,长度为1497bp的开放阅读框编码一个由498个氨基酸组成的蛋白质,包含2个WRKY结构域,属于WRKY转录因子家族中第一组的成员。采用实时荧光定量PCR的方法对ZmWRKY33的表达谱进行分析,结果显示,ZmWRKY33在玉米的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、幼嫩的籽粒中均有表达,但在根中的表达量最高；对四叶一芯期的玉米进行各种非生物胁迫,发现ZmWRKY33受到干旱（20%PEG6000）、高盐（250mM NaCl）.低温（4℃）和ABA（100μM）的显著诱导,其中受到高盐和干旱诱导的上调表达最为强烈。以上试验结果表明ZmWRKY33可能通过ABA依赖的信号转导途径参与玉米应答非生物胁迫的过程。为了进一步验证ZmWRKY33的基因功能,构建了包含该基因的植物双元表达载体,通过农杆菌蘸花法将该基因转入野生型拟南芥中,PCR及RT-PCR结果表明ZmWRKY33已经整合入野生型拟南芥的基因组中,并在转录水平得到表达。耐盐性试验表明,在遭受到一定浓度的盐胁迫处理时,转基因植株比野生型植株表现出更强的胁迫耐受性,而且在胁迫终止后转基因植株恢复正常生长状态的速度比野生型更快。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 植物转录因子
• 1.1 植物转录因子概述
• 1.2 转录因子的结构
• 1.2.1 DNA结合结构域
• 1.2.2 核定位信号
• 1.2.3 寡聚化位
• 1.2.4 转录调控结构域
• 1.3 转录因子的分类
• 1.4 植物转录因子与非生物胁迫的关系
• 2 WRKY转录因子
• 2.1 WRKY转录因子概述
• 2.2 WRKY转录因子结构特征
• 2.3 WRKY转录因子的分类
• 2.4 WRKY转录因子的功能
• 2.4.1 参与植物的生物逆境胁迫应答
• 2.4.2 参与植物的非生物逆境胁迫应答
• 2.4.3 参与植物的生长发育
• 2.4.4 参与植物的物质代谢
• 3 电子克隆技术
• 3.1 诞生背景
• 3.2 电子克隆的实施策略
• 3.2.1 利用EST数据库信息实施电子克隆
• 3.2.2 利用基因组数据库信息实施电子克隆
• 3.3 在植物新基因克隆中的应用
• 3.4 存在问题及应用前景
• 4 本研究的目的意义及内容
• 第二章 ZmWRKY33的克隆和表达谱分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 化学试剂、酶制剂及试剂盒
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的基因的电子克隆
• 2.2.2 目的基因的生物信息学分析
• 2.2.3 从基因组DNA中克隆目的基因
• 2.2.3.1 玉米基因组DNA的提取
• 2.2.3.2 目的基因的PCR扩增
• 2.2.3.3 扩增产物的纯化
• 2.2.3.4 连接反应
• 2.2.3.5 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.4 从cDNA中克隆目的基因
• 2.2.4.1 玉米植株总RNA的提取
• 2.2.4.2 cDNA的合成
• 2.2.4.3 目的基因的RT-PCR扩增
• 2.2.5 植物材料处理
• 2.2.6 实时荧光定量PCR分析表达谱
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米基因ZmWRKY33的克隆
• 3.2 玉米基因ZmWRKY33的序列分析
• 3.3 玉米基因ZmWRKY33的基因组结构
• 3.4 玉米基因ZmWRKY33的表达模式分析
• 3.4.1 在玉米不同组织中的表达模式
• 3.4.2 ZmWRKY33在激素诱导下的表达模式
• 3.4.3 ZmWRKY33在非生物胁迫诱导下的表达模式
• 4 讨论
• 第三章 ZmWRKY33在转基因拟南芥中的功能分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 细菌菌株和质粒
• 2.3 化学试剂和酶制剂
• 2.4 方法
• 2.4.1 含ZmWRKY33的农杆菌双元载体的构建
• 2.4.2 电击法转化农杆菌
• 2.4.3 拟南芥转化
• 2.4.3.1 拟南芥的培养
• 2.4.3.2 农杆菌的准备
• 2.4.3.3 蘸花法转化拟南芥
• 2.4.3.4 拟南芥转化种子的筛选
• 2.4.4 转基因阳性植株的检测
• 2.4.5 拟南芥转基因植株的功能分析
• 3 结果与分析
• 3.1 ZmWRKY33农杆菌转化双元载体的构建
• 3.2 拟南芥转基因阳性植株的鉴定
• 3.3 拟南芥转基因植株对盐胁迫的反应
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录 各类试剂的配制
• 致谢