不同亚型流感病毒NS1与PSD-95相互作用及对神经元NO的影响

论文摘要

背景:A型流感病毒Non-structrual protein 1 （NS1）能与宿主细胞内众多蛋白相互作用,表现为对宿主的免疫抑制作用,并影响信号转导和蛋白质合成。NS1蛋白含有约230个氨基酸片段,C-末端4个氨基酸被称为PDZ结合基序（PDZ binding motif）。突触后密度蛋白（Postsynaptic Density Proteins, PSD-95）主要存在于神经元细胞,含有3个PDZ结构区域（PDZ domain）。PSD-95作为神经元细胞鹰架蛋白,结合了众多功能蛋白。PSD-95在神经元细胞离子平衡,信号转导, N-甲基-D-门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR）聚集等方面均发挥着重要作用。目的:为了研究A型流感病毒NS1与PSD-95蛋白之间存在的相互作用及不同亚型流感病毒NS1与PSD-95相互作用的差异;检测这两种蛋白结合作用对神经元细胞功能的影响。利用基因克隆技术,通过GST-pull down,酵母双杂交,免疫共沉淀,免疫荧光定位等技术来确定不同亚型流感病毒NS1蛋白与神经元突触后密度蛋白PSD-95之间的相互作用。通过测定nitric oxide （NO）含量变化来证实NS1与PSD-95相互结合后对神经元细胞功能的影响。方法:通过GST-pull down证实NS1与PSD-95在体外的相互结合;酵母双杂交及α-半乳糖苷酶活性测定,模拟NS1与PSD-95在体内的相互作用;免疫共沉淀,免疫荧光定位确定NS1与PSD-95在哺乳动物细胞内相互结合情况;通过Griess reagent检测亚硝酸盐,确定细胞内NO产物含量。结果:A/Shantou/169/2006 （ST169, H1N1）、A/Shantou/602/06 （ST602, H3N2）、A/Guangdong/1/2005 （GD05, H5N1）、A/Quail/HongKong/G1/97 （G1, H9N2）各亚型病毒中,仅H5N1亚型流感病毒的NS1 （NS51）能够与PSD-95相互作用;酵母双杂交,X-gal,α-半乳糖苷酶活性检测中,转染PGAD-NS51+PGBK-PSD-95的酵母菌AH109能在-ade/-leu/-trp/-his培养基（quadruple drop-out medium, QDO）平板上生长,X-gal强阳性,α-半乳糖苷酶活性单位为3.504±0.082 millunit/ml;转染PGAD-NS11+PGBK-PSD-95的AH109在QDO仅极少菌落生长,X-gal弱阳性,α-半乳糖苷酶活性单位为0.184±0.112 millunit/ml;（阳性对照:1.252±0.065 millunit/ml,阴性对照:0.061±0.023 millunit/ml）;GST-pull down,免疫共沉淀试验中,仅NS51与PSD-95存在相互结合;NO产物检测,确定NS51与PSD-95相互作用后对神经元功能的影响,结果表明:使用慢病毒lentivirus-NS51感染大鼠海马神经元,NO产生被抑制;pcDNA-NS51,pcDNA-NS11分别转染人神经瘤细胞系SH-SY-5Y,NS51组NO产生被抑制,NS11组NO产生显著增加。结论:实验发现了H5N1亚型流感病毒NS1与神经元突触后密度蛋白PSD-95之间存在相互作用;而其它亚型NS11,NS32,NS92则不能与PSD-95结合;说明不同亚型流感病毒与PSD-95结合特性上存在差异;另外,NS1与神经元PSD-95相互结合能够抑制神经元NO的产生。材料与方法选取由本实验室提供的A型流感病毒A/Shantou/169/2006 （ST169, H1N1）, A/Shantou/602/06 （ST602, H3N2）, A/Guangdong/1/2005 （GD05, H5N1）, A/Quail/HongKong/G1/97 （G1, H9N2）,选用流感病毒分离鉴定细胞系Madin-Darby canine kidney （MDCK）细胞,通过空斑形成试验（Plaque-forming assay）,得到流感病毒A/Shantou/169/2006 （ST169）、A/Shantou/602/06 （ST602）、A/Guangdong/1/2005 （GD05）、A/Quail/HongKong/G1/97 （G1）的空斑形成单位（Plaque forming unit, PFU）分别为1.2×107PFU/ml、4.2×107PFU/ml、1.1×106PFU/ml、1.0×106 PFU/ml;MDCK细胞使用含10%FBS的DMEM进行培养,大鼠海马神经元细胞则使用含10% FBS, 1% B27的neurobasal培养基进行培养;构建相应载体: pGAD-NS11, pGAD-NS32, pGAD-NS51, pGAD-NS92, pGBK-PSD-95, flag-PSD-95, pcDNA-NS11, pcDNA-NS32, pcDNA-NS51, pcDNA-NS92, pcDNA-PSD-95,慢病毒Lentivirus-NS51 （NS11表示ST169的NS1,NS32表示ST602的NS1,NS51表示GD05的NS1,NS92表示G1的NS1）进行包括GST-pull down、酵母双杂交、免疫共沉淀（Co-IP）在内的试验以检测不同亚型流感病毒NS1与突触后密度蛋白PSD-95之间的相互作用;其它相关试剂包括:兔抗PSD-95抗体,小鼠抗NS1抗体,Protein G magnetic beads,HRP标记的二抗以及Cy3和Alexa488标记的羊抗兔,羊抗小鼠二抗;使用碧云天的总Nitric oxide （NO）检测试剂盒检测NS1与PSD-95相互结合后,对细胞内NO含量的影响。结果1.空斑形成试验测得ST169 （H1N1）、ST602 （H3N2）、GD05 （H5N1）、G1 （H9N2）的空斑形成单位PFU分别为:1.2×107PFU/ml,4.2×107PFU/ml,1.1×106PFU/ml,1.0×106 PFU/ml;2.酵母双杂交试验表明,流感病毒NS51与PSD-95能够相互结合, NS11与PSD-95不存在或仅存在微弱的相互结合,NS32,NS92与PSD-95则不存在相互结合;X-gal试验表明,NS51,NS11与PSD-95能够相互作用,而NS32,NS92与PSD-95则不存在相互作用;α-半乳糖苷酶活性单位检测表明,NS51与PSD-95能够相互作用;3. GST-pull down结果显示:NS51与PSD-95能够相互结合,而NS11与PSD-95不存在相互结合;4. Co-IP结果显示:仅NS51与PSD-95存在相互结合;5.免疫荧光结果表明:神经元,SH-SY-5Y细胞中,NS51与PSD-95存在共定位;6. NO检测显示:慢病毒Lentivirus-NS51感染神经元细胞,NS51能够抑制NO产物的产生;SH-SY-5Y细胞中,NS51能够抑制NO产物的产生,而NS11则促进NO产物的产生;结论1.不同亚型流感病毒NS1与PSD-95存在不同的结合特性,NS51与PSD-95能够相互结合,而其它亚型流感病毒NS1 （NS11, NS32, NS92）与PSD-95不存在相互结合;2.流感病毒NS1与PSD-95蛋白的相互结合,能够抑制人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y,及神经元细胞中NO的产生和释放;

论文目录

• 中文摘要（Chinese Abstract）
• 英文摘要（English Abstract）
• 第1章 前言（Introduction）
• 第2章 材料和方法（Materials and Methods）
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计学方法
• 第3章 结果（Results）
• 第4章 讨论（Discussion）
• 第5章 结论（Conclusions）
• 不同亚型流感病毒在单个核细胞内复制情况研究
• 第1章 前言
• 第2章 材料和方法
• 第3章 结果
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献（References）
• 在读期间发表论文
• 个人简介
• 致谢（Acknowledgement）
• 附录（Appendix）