苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究

论文题目: 苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 农药学

作者: 黄必旺

导师: 关雄

关键词: 苏云金杆菌,肠毒素,基因检测,基因定位,基因克隆,安全性

文献来源: 福建农林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)是一种昆虫病原细菌,因其产生的毒素对多种害虫有特异的毒杀作用而发展成为一种成功的微生物杀虫剂,广泛用于农林及卫生害虫的生物防治。Bt商业化应用已有60多年的历史,多年以来,Bt制剂一直被认为是安全的生物杀虫剂,因为最初认为它仅对鳞翅目昆虫有毒性,而对哺乳动物和非靶标生物无毒。但是,随着对Bt研究的深入,每年都有新的菌株和毒素被鉴定出来,其杀虫谱也越来越宽广。现在认为,Bt含有的多种毒素不仅对无脊椎动物节肢动物门的鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目、半翅目、等翅目等16个目有毒性,还对线性动物门、原生动物门、扁形动物门中的有些种类有杀虫活性,其中也有一些对人及哺乳动物有害。这对“Bt仅对鳞翅目昆虫有毒性”的安全性基础产生了很大冲击。另外,Bt与作为病原菌的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus简称Bc)在形态、生理及基因组等很多方面具有高度的相似性。近年发现Bt含有与蜡状芽孢杆菌具有很高的同源性的可能对人和动物有害的溶血素及肠毒素等,这对Bt的安全性提出了新挑战。 采用已发表的蜡状芽孢杆菌肠毒素基因的序列设计三对特异引物Hb11/Hb12、BceT1/BceT2和Ent1/Ent2,对16株本室保存及45株引自美国芽孢杆菌遗传保藏中心(BGSC)苏云金芽孢杆菌进行了溶血素BL、肠毒素T和ent基因三种肠毒素基因的PCR检测。结果表明,含有hb1A基因、ent基因及bceT基因的BGSC菌株分别占60%、44.4%及66.7%,本室保存菌株含有hb1A基因、ent基因及bceT基因的比例分别为:100%、93.8%及68.8%。将Bt 8010 hb1A基因、ent基因及bceT基因的PCR产物回收纯化后测序,经NCBI网站在线的BLAST软件进行同源性分析,结果如下,hb1A基因片段与已

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第1章 前言

1 苏云金芽孢杆菌概述

1.1 分布与分类

1.2 作用方式与活性谱

1.3 工业化生产

2 苏云金芽孢杆菌的活性成分

2.1 δ-内毒素

2.2 外毒素

2.3 Vip蛋白

2.4 几丁质酶

3 苏云金芽孢杆菌的肠毒素

3.1 Bt肠毒素基因的检测

3.2 Bt肠毒素的活性

3.3 Bt肠毒素基因的克隆与序列分析

4 苏云金芽孢杆菌对生态的影响

4.1 对有益昆虫的影响

4.2 对鸟类的影响

4.3 对其它生物的影响

5 苏云金芽孢杆菌对哺乳动物及人的影响

5.1 Bt对小动物的影响

5.2 对人类的影响

6 苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌的相似性

7 本研究的意义

第2章 苏云金杆菌肠毒素基因的检测与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 培养基

1.1.3 酶与试剂

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取与定量

1.2.2 引物设计

1.2.3 PCR

1.2.4 PCR产物回收

1.2.5 DNA序列测定与分析

2 结果与分析

2.1 hblA基因的PCR检测

2.2 ent基因的PCR检测

2.3 bceT基因的PCR检测

2.4 肠毒素基因片段的序列比较

3 小结与讨论

第3章 苏云金芽孢杆菌8010 ent基因的定位

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 酶与试剂

1.2 方法

1.2.1 DNA样品的制备

1.2.1.1 微量碱裂解法提取质粒DNA

1.2.1.2 BGSC法提取质粒DNA

1.2.1.3 Bt质粒DNA提取的改进方法

1.2.1.4 染色体DNA的制备

1.2.2 电泳分析

1.2.3 Southern转移与杂交成像

1.2.3.1 探针制备

1.2.3.2 Southern转移

1.2.3.3 DNA固定

1.2.3.4 杂交与洗膜

1.2.3.5 曝光与成像

2 结果与分析

2.1 三种提取Bt质粒方法的比较

2.2 ent基因的定位

3 小结与讨论

3.1 质粒DNA的制备

3.2 Southern杂交

3.3 ent基因的定位

第4章 苏云金杆菌肠毒素基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 质粒载体

1.1.3 酶与试剂

1.2 方法

1.2.1 制备PCR简易模板

1.2.2 引物设计

1.2.3 高保真酶PCR

1.2.4 琼脂糖凝胶中回收PCR产物

1.2.5 PCR产物加A尾

1.2.6 质粒连接

1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备

1.2.8 转化

1.2.9 质粒提取

1.2.10 重组克隆的PCR快速鉴定

1.2.11 DNA序列测定及分析

2 结果与分析

2.1 肠毒素ent基因ORF的克隆

2.2 序列分析

2.2.1 ent基因序列同源性分析

2.2.2 氨基酸编码序列分析

2.2.3 编码氨基酸序列的同源分析

3 小结与讨论

第5章 苏云金杆菌肠毒素的急性毒性试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 供试小鼠

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

1.2.2 小鼠的饲养

1.2.3 口服急性毒性试验方法

1.2.4 小鼠解剖

2 结果与分析

2.1 小鼠饲养观察

2.2 小鼠体重比较

2.3 小鼠解剖观察

3 小结与讨论

第6章 总结与讨论

1 本研究的结论

2 苏云金芽孢杆菌的风险讨论

2.1 Bt安全吗?

2.2 存在的问题与未来研究的方向

2.3 Bt的安全应用

参考文献

附录1 缩略词

附录2 攻读博士期间发表(或投稿)论文

致谢

发布时间: 2005-09-27

参考文献

• [1].苏云金芽孢杆菌vip3A基因及杀虫防病工程菌研究[D]. 吴燕榕.福建农林大学2004
• [2].苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平.中国农业科学院2003
• [3].苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D]. 黄志鹏.福建农林大学2005
• [4].苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究[D]. 罗兰.西北农林科技大学2005
• [5].苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D]. 黄天培.福建农林大学2006
• [6].苏云金芽孢杆菌LLP29菌株的分离及其对白纹伊蚊作用机理的研究[D]. 张灵玲.福建农林大学2007
• [7].苏云金芽孢杆菌新助剂筛选及发酵因子优化[D]. 黄勤清.福建农林大学2006
• [8].苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达[D]. 郎志宏.中国农业科学院2005
• [9].苏云金芽孢杆菌FS140菌株蛋白酶的研究[D]. 郑毅.福建农林大学2008
• [10].高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D]. 姚江.中国农业科学院2002

相关论文

• [1].高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D]. 姚江.中国农业科学院2002
• [2].苏云金芽孢杆菌vip3A基因及杀虫防病工程菌研究[D]. 吴燕榕.福建农林大学2004
• [3].苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平.中国农业科学院2003
• [4].高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究[D]. 王广君.中国农业科学院2005
• [5].苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D]. 黄志鹏.福建农林大学2005
• [6].苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究[D]. 罗兰.西北农林科技大学2005
• [7].苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶纯化、性质研究及其mel基因的克隆和表达[D]. 刘楠.武汉大学2004
• [8].苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D]. 黄天培.福建农林大学2006
• [9].苏云金芽孢杆菌LLP29菌株的分离及其对白纹伊蚊作用机理的研究[D]. 张灵玲.福建农林大学2007
• [10].苏云金芽孢杆菌新助剂筛选及发酵因子优化[D]. 黄勤清.福建农林大学2006

标签：苏云金杆菌论文;  肠毒素论文;  基因检测论文;  基因定位论文;  基因克隆论文;  安全性论文;