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用于活性污泥性能评价的微生物群落芯片的研制

2020-12-07阅读(859)

用于活性污泥性能评价的微生物群落芯片的研制

论文摘要

活性污泥是一种由细菌等微生物和原生动物、后生动物等微型动物组成的生态系统,由于它具有菌群结构多样、菌群功能复杂等特点,因此有关其菌群的研究一直受到普遍的关注。其中,研究活性污泥菌群分布与功能的关系,了解活性污泥群落结构及其动态变化,获得与活性污泥状态与功能息息相关的关键微生物及污泥性能评价的指示微生物,具有十分重要的意义。然而,目前尚无有效的手段对此进行研究。本研究针对活性污泥中的自然细菌,利用分子克隆和测序技术获得其细菌菌群的16S rRNA分子相关遗传信息,在全面了解活性污泥细菌群落结构的基础上,制备了一种快速、高效、较全面反映活性污泥菌群信息的活性污泥寡核苷酸原核生物群落芯片,同时,通过污泥膨胀发生过程中不同污泥样品RNA的RT-PCR产物与之杂交及其数据分析,获得了污泥膨胀发生前后的差异微生物,最后再通过荧光原位杂交（FISH）的验证,确定了污泥膨胀发生过程的指示微生物。1.活性污泥高质量RNA提取方法:通过比较RNA产量、纯度、降解程度、特定基因的扩增能力、微生物多样性等评价指标,考察和探讨了5种不同RNA提取方法对活性污泥总RNA提取效果的影响并最终建立了一种快速、有效的活性污泥RNA提取方法,即在TENP和PBS洗涤沉淀污泥的基础上,分别采用溶菌酶和TRIzol裂解活性污泥细菌、氯仿去除细菌裂解液中的蛋白和大部分DNA、异丙醇沉淀核酸和DNase I水解残留DNA后,最后进一步用离心柱纯化RNA。结果表明,这种方法可以有效提取高质量的菌群RNA,不仅提取的RNA总量多（每g污泥可提取169.6μg RNA）、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富生物多样性,而且可同时进行16S rRNA和amoA基因的RT-PCR扩增反应;与其它方法相比,性价比高,具有明显的优越性,适用于活性污泥RNA的大量提取,同时,T-RFLP结果证明RNA提取方法对待分析样品的微生物种类和丰度分析结果影响较大,不同的RNA提取方法所获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同。2.SBR活性污泥细菌多样性的分析:通过16S rRNA文库的构建及其克隆子的RFLP分析、测序,对SBR活性污泥的细菌种类进行了分析。结果表明,建立的16S rRNA文库代表细菌类群分为75个OTU,其中,主要为β-变形杆菌亚门,占49.9%,其次分别为拟杆菌门（20.4%）、α-变形杆菌亚门（18.9%）、厚壁菌门（4.4%）、其它（δ-、ε-变形杆菌亚门、浮霉菌门、酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、蓝藻门等）占6.4%;活性污泥的细菌种类涉及30余个种属,其中动胶菌属、陶厄氏菌属、红细菌属为克隆文库中优势菌株,分别占30.0%、10.6%、9.1%,另外,还有乳球菌属、中慢生根瘤菌属、副球菌属、甲基杆菌属等;3.活性污泥微生物群落芯片的研制及其效能评价:针对75个OTUs的16S rRNA的V3区和V5、V6区分别设计了两对通用引物,并且制备了由针对其中的57种OTUs的64种探针组成的微生物群落芯片。对该芯片的特异性、敏感性和重复性进行评测的结果表明,该微生物群落芯片能够有效区分各OTUs,对不同的OTUs具有良好的特异性杂交图谱;重复性良好;PCR扩增灵敏度为100 CFU/mL,同时,为了得到强的特异性的荧光信号,应该直接取PCR扩增产物进行检测;4.活性污泥微生物群落芯片的应用:为了验证建立的技术方法可以进行活性污泥性能评价,通过构建污泥膨胀模型并将污泥膨胀发生过程中不同污泥样品RNA的RT-PCR产物与微生物群落芯片杂交而获得污泥膨胀的指示细菌。数据分析结果表明,活性污泥发生非丝状菌膨胀过程中,链球菌科（Streptococcaceae）、黄杆菌属（Flavobacterium）的细菌不断增加,而纤毛虫的共生菌、拟杆菌门（Bacteroidetes）的某些细菌、屈挠杆菌科（Flexibacteraceae）中Runella属细菌则明显减少,通过FISH也验证了随着污泥膨胀的发生,黄杆菌分布明显增多,为非丝状菌膨胀的指示细菌。因此,该微生物群落芯片可以在不同分类层次快速分析大量活性污泥微生物,与其它基因芯片技术相比,可以同时给出更多的微生物群落信息,可以监测特定菌群在不同条件下的动态变化并获得污泥性能评价的指示微生物。本研究将对今后分析污泥菌群分布与功能的关系、了解环境因素改变对其微生物生态的影响具有重要意义。

论文目录

  • 缩略词表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 第一章 活性污泥群落芯片RNA提取方法研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 样品的洗涤
  • 1.2.2 RNA的提取和纯化
  • 1.3 RNA的提取效率及质量评价
  • 1.3.1 RNA的降解程度
  • 1.3.2 RNA的纯度和含量
  • 1.3.3 RT-PCR扩增
  • 1.3.4 T-RFLP分析
  • 2 结果
  • 2.1 RNA产物的浓度和纯度
  • 2.2 RNA降解程度
  • 2.3 RT-PCR扩增
  • 2.4 T-RFLP分析
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 第二章 序批间歇式反应器活性污泥细菌多样性分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 实验运行装置和运行方式
  • 1.2.2 实验用水及种泥来源
  • 1.2.3 水质指标的测定
  • 1.2.4 活性污泥总RNA的提取
  • 1.2.5 16S rRNA克隆文库构建
  • 1.2.6 RFLP分析
  • 1.2.7 核酸测序
  • 1.2.8 细菌多样性分析及评价
  • 1.2.9 系统发育分析
  • 1.2.10 核酸序列注册登录号
  • 2 结果
  • 2.1 活性污泥样品性质
  • 2.2 16S rRNA克隆文库的构建和筛选
  • 2.3 物种丰富度和多样性分析
  • 2.4 系统发育分析
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 第三章 引物与探针的设计及合成
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 应用序列分析软件设计引物和探针
  • 1.2.2 各OTUs16S rDNA基因片段的获得
  • 1.2.3 通用引物扩增性能
  • 2 结果
  • 2.1 序列的碱基对齐结果
  • 2.2 通用引物的设计和确定
  • 2.3 寡核苷酸探针设计结果
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 第四章 微生物群落芯片的效能评测
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 基因芯片的制备过程
  • 1.2.2 样品的荧光标记方法
  • 1.2.3 荧光标记样品与群落芯片的杂交
  • 1.2.4 微生物群落芯片的信号扫描及分析
  • 1.2.5 群落芯片特异性检测
  • 1.2.6 群落芯片敏感性评测
  • 1.2.7 群落芯片重复性评价
  • 2 结果
  • 2.1 荧光标记检测样品的获得
  • 2.2 微生物群落芯片的制备
  • 2.3 群落芯片的特异性
  • 2.4 群落芯片的敏感性
  • 2.4.1 PCR扩增灵敏度
  • 2.4.2 检测样品核酸的敏感性
  • 2.4.3 杂交检测灵敏度
  • 2.5 群落芯片的重复性
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 第五章 微生物群落芯片的初步应用——污泥膨胀菌群研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 实验运行装置和运行方式
  • 1.2.2 实验用水及种泥来源
  • 1.2.3 水样测试项目和方法
  • 1.2.4 污泥性状测试项目和方法
  • 1.2.5 活性污泥的显微镜观察
  • 1.2.6 微生物群落芯片的杂交、检测和分析
  • 1.2.7 荧光原位杂交（FISH）
  • 2 结果
  • 2.1 活性污泥SVI的变化
  • +4-N去除效果的变化'>2.2 出水COD 和NH+4-N去除效果的变化
  • 2.3 活性污泥形态学及其生物相的变化
  • 2.4 微生物群落变化分析
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 结论
  • 工作展望
  • 参考文献
  • 图表附录
  • 个人简历
  • 致谢

    • 相关论文文献

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