一、棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)（论文文献综述）
刘志成[1]（2021）在《甜菜夜蛾miR-2763对Se301细胞和甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）感染的影响》文中指出
樊江斌[2]（2020）在《苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究》文中研究指明苹果蠹蛾颗粒体病毒（Cydia pomonella granulovirus,Cp GV）是一种对苹果蠹蛾（Cydia pomonella L.）幼虫具有专一性和高致病性的病原微生物。目前,Cp GV已经被开发成生物杀虫剂,应用在数十万公顷的苹果和梨等蔷薇科水果的种植生产中,是最成功的杆状病毒商业化产品之一。近年来,田间发现的三种抗Cp GV（I-III型）的苹果蠹蛾种群以及可以克服这三种抗性的Cp GV分离株,为研究杆状病毒宿主相互适应性提供了理想的模型。本论文旨在阐明中国西北地区收集的Cp GV分离株对敏感和抗性苹果蠹蛾种群的毒力差异,病毒基因组多态性。同时开展了苹果蠹蛾颗粒体病毒增效剂的研究。运用Illumina二代测序技术分析七个Cp GV分离株的种群结构,包括Cp GV-ZY、-JQ、-ALE、-KS1、-KS2、-ZY2和-WW,寻找这些新分离株基因型和生物学差异之间的关联性。研究所获主要结果如下:1.七个Cp GV对抗性苹果蠹蛾的生测结果表明Cp GV-JQ、-KS1和-ZY2可以克服I型抗性,感染幼虫的死亡时间明显延迟。新分离株遵循克服抗性的“pe38模型”,即缺少2×12 bp重复序列。尽管Cp GV-WW具有克服I型的特征,但是它不能高效杀死I型抗性苹果蠹蛾,却克服II型和III型抗性苹果蠹蛾。除了Cp GV-WW以外,其他Cp GV分离株生物测定结果与分离株的pe38重复序列结构之间的相关性与前人研究结论一致,即pe38基因是苹果蠹蛾Cp RR1中抗性靶标。2.根据Illumina二代测序数据,完成基因组组装和注释,系统发育分析。结果表明,尽管这些分离株采样地点相距甚远,但是它们的基因组高度保守且和已知Cp GV分离株有关联。基于系统发育树研究表明,除了已报道的五个基因组类群A,B,C,D和E,发现和命名了两个基因组类群F（Cp GV-JQ和-ZY2）和基因组类群G（Cp GV-ALE）。设定Cp GV-M为参考基因组,定量不同分离株基因组类群特异性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）的组份,确定其遗传构成。共发现563个SNPs,其中新发现223个SNPs属于这七个Cp GV。Cp GV-WW在基因组构成上是高度同质的,属于基因组类群E。其他的六种分离株则是由至少两种基因组类群组成的混合物。其中Cp GV-ZY、-KS1和-KS2基因组构成非常相似,分别由不同比例的基因组类群A（Cp GV-M）和基因组类群E（Cp GV-WW）组成。3.室内和半田间生测结果表明,在病毒悬液中添加7mg/ml的氧化铁能够显着提高Cp GV在田间的活性和持久性,与未添加氧化铁处理相比较,初孵幼虫死亡率分别提高了53.88%和96.64%。说明添加低剂量氧化铁,增强了Cp GV对田间强日光、强紫外线的适应性,提高了该病毒在田间的活性和持久性,说明氧化铁有作为商业化Cp GV产品助剂的潜力,能提高Cp GV对苹果蠹蛾防治效果。4.喂食半致死剂量的Cp GV病毒后,研究敏感性和抗性苹果蠹蛾三龄幼虫热休克蛋白hsp70-1和hsp70-2转录水平变化。与未处理对照相比,在Cp S幼虫中Cp GV-M和-S感染引起hsp70-1和hsp70-2转录水平先增加,后降低。与对照比较,Cp GV-S感染引起Cp RR1幼虫hsp70-1和hsp70-2转录水平在侵染前期保持稳定,至第7天时转录水平增加了3倍多。对比hsp70s在Cp S和Cp RR1幼虫转录时相,发现Cp GV诱导hsp70s上调在Cp RR1幼虫中延迟了大约2天。当Cp GV在苹果蠹蛾幼虫体内成功建立侵染时,hsp70s转录水平上调。综上所述,七个Cp GV分离株对不同抗性苹果蠹蛾种群的毒力差异明显,其中高毒力分离株为Cp GV可持续防治苹果蠹蛾提供了病毒资源。根据基因组类群特异性SNP分布和频率计算未知分离株基因型组成和遗传多样性的方法可推广到其他（杆状）病毒。低剂量氧化铁可保护Cp GV免受紫外线伤害,具有发展成Cp GV助剂的潜力。热休克蛋白hsp70s与Cp GV在苹果蠹蛾幼虫体内成功建立侵染有关。理解杆状病毒种群结构和遗传适应性之间的关系,以及合理利用病毒保护剂提高田间防效,有助于改善当前Cp GV抗性治理和生物防治持续发展。
李红[3]（2020）在《EoNPV基因组分析及对茶尺蠖两近缘种毒力差异研究》文中研究指明茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis obliqua nucleopolyhedrosis virus,EoNPV）是一种重要的病原类微生物,可以感染茶尺蠖幼虫致其死亡。茶园中的主要食叶性害虫有茶尺蠖和灰茶尺蠖两个近缘种,二者形态和食性相似,长期以来都被当做一个种研究。因此与茶尺蠖相关的研究结果可能与真实情况间存在差异,特别是以EoNPV作为生物农药防治茶园中的茶尺蠖和灰茶尺蠖时,不同种间的防治效果会存在差异。因此,本文利用三代Oxford Nanopore测序技术测定了茶尺蠖核型多角体病毒的全基因组序列,采用叶盘饲毒法比较了茶尺蠖病毒对茶尺蠖和灰茶尺蠖的LD50（median lethal dose;半致死剂量）,明确EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异,进而比较了前期课题筛选出的高效毒株（H-EoNPV）与现有（原始）毒株（EoNPV）对灰茶尺蠖的致死率和LD50的差异,为茶尺蠖两近缘种的田间科学防治提供依据。1.测定和分析了茶尺蠖核型多角体病毒的全基因序列。从测序结果看,EoNPV基因组全长为132,043 bp,其中G+C的占总含量的37.51%,对EoNPV基因组功能基因的预测结果显示,共预测到106个开放阅读框（ORF）,基因组中ORFs区域的G+C含量为38.96%,与整体的G+C含量相近。目前共有78条基因完成注释。在EoNPV基因组中共测到3个同源重复区域（hrs1,hrs2,hrs3）。通过分析EoNPV的基因组可能有两个ORF为EoNPV所独有,目前尚未在其他的杆状病毒中找到同源序列。2.比较明确了茶尺蠖核型多角体病毒对3龄茶尺蠖和灰茶尺蠖幼虫的毒力差异。研究结果显示:（1）在相同剂量和时间条件下处理茶尺蠖幼虫的死亡率要高于灰茶尺蠖;（2）EoNPV对茶尺蠖的LD50和LT50（median lethal time;半致死时间）均小于对灰茶尺蠖的。EoNPV对灰茶尺蠖的LD50是对茶尺蠖的28.9倍,且在2×107（PIB/头）剂量处理时,EoNPV对灰茶尺蠖的LT50约为对茶尺蠖的2倍,在2×106（PIB/头）剂量处理下,EoNPV对灰茶尺蠖的LT50约为对茶尺蠖的1.35倍。上述结果表明,EoNPV对茶尺蠖的毒力高于灰茶尺蠖。3.比较了茶尺蠖病毒高效毒株（H-EoNPV）和原始毒株（EoNPV）对3龄灰茶尺蠖的毒力差异。研究结果显示:（1）茶尺蠖病毒高效毒株的毒力与原始毒株间的毒力存在差异。（2）H-EoNPV毒株对灰茶尺蠖的致死率高于EoNPV毒株。（3）EoNPV毒株饲喂灰茶尺蠖后的LD50和LT50均高于H-EoNPV毒株。EoNPV对灰茶尺蠖的LD50是茶尺蠖的3.1-25.8倍。上述结果表明,H-EoNPV毒株对灰茶尺蠖的毒力明显高于EoNPV毒株,H-EoNPV毒株对不同地理种群的灰茶尺蠖间的毒力也存在差异。
郑思敏[4]（2020）在《家蚕围食膜因子基因Bm011851在幼虫感染BmNPV过程中的功能研究》文中指出家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,具有重要的经济价值。家蚕生长发育过程会受到各种病原微生物的威胁,其中家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）引起的家蚕病毒病占蚕病的70%,对蚕业生产造成了严重影响。围食膜（PM）是昆虫抵抗外源病源微生物入侵的第一道防线,围食膜因子与外源病原微生物入侵昆虫中肠细胞存在密切关系。研究家蚕围食膜因子在幼虫感染BmNPV过程中的功能,可为抗性育种和害虫防治提供新的基因资源和理论依据。本文以家蚕围食膜因子基因Bm011851为研究对象,克隆并分析了家蚕围食膜因子基因Bm011851,获得并检测了过表达Bm011851转基因家蚕幼虫的生长发育、经济性状及其对PM表面结构的影响,研究了Bm011851在BmNPV感染家蚕幼虫过程中的功能,以解析Bm011851参与抵抗病毒入侵的机制。主要研究结果如下:1.家蚕围食膜因子基因Bm011851的克隆及表达分析基因表达分析显示Bm011851在家蚕幼虫期表达,进食期表达量高于眠期,5龄时表达量达到最高水平,5龄6天后表达量开始下降;Bm011851在中肠中高量表达,且中部中肠和后部中肠表达量高于前部中肠,在前肠、后肠和其他组织器官中几乎不表达。克隆结果显示Bm011851的ORF全长为1620 bp,编码539个氨基酸,推导的蛋白质序列无O-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点,有1个跨膜结构域和1个N-端信号肽。4龄幼虫经口感染BmNPV后3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、48 h、78 h、84 h,中肠组织中Bm011851表达显着上调。2.过表达Bm011851转基因家蚕的获得构建了pBac[3×P3-dsred-SV40+OpIE2-Bm011851-V5-His-OpIE2pA]转基因过表达载体,并进行蚕卵的显微注射,筛选获得阳性家蚕。分子生物学检测发现Bm011851成功在家蚕中过表达。统计转基因品系家蚕幼虫的体重、全茧重、茧层量、茧层率等,发现过表达Bm011851不影响家蚕的正常生长发育和主要经济性状。扫描电镜观察发现转基因过表达Bm011851没有直接影响PM的表面结构。qRT-PCR检测发现转基因家蚕中其他围食膜因子基因Bm001504、Bm009641、Bm001491、Bm000185的表达与对照相比,无明显变化。表明获得的转基因家蚕能用于Bm011851的功能研究。3.Bm011851基因在BmNPV感染家蚕幼虫过程中的功能研究调查发现转基因过表达Bm011851基因能提高BmNPV感染后幼虫的存活率,且BmNPV半致死剂量较对照相比提高了约10倍。过表达Bm011851能抑制BmNPV增值复制必须早期基因（ie1）、中期基因（vp39）和晚期基因（p10）的表达。扫描电镜观察转基因家蚕感染BmNPV后不同时间点PM表面结构,发现过表达Bm011851能减轻BmNPV对PM的破坏程度,有利于维持PM的完整性。中肠组织切片观察发现Bm011851能减轻BmNPV入侵过程中对家蚕中肠细胞的破坏,维持中肠细胞的稳定性。围食膜因子可能通过抑制病毒复制、影响PM完整性和中肠组织细胞稳定性来影响BmNPV对家蚕幼虫的侵染。其中的机制需要进一步研究。
郭望[5]（2019）在《利用BmNPV Bac-to-Bac系统在家蚕体内表达狂犬病毒M蛋白及抗体制备》文中认为杆状病毒表达载体系统（Baculovirus Expression Vector System,BEVS）是将外源目的基因导入杆状病毒基因组,获得重组病毒,然后以此作为载体感染昆虫幼虫或其培养细胞。Bac-to-Bac表达系统通过位点特异性转座,在大肠杆菌内完成杆状病毒基因组的重组。BmNPV Bac-to-Bac杆状病毒表达系统由于能够以家蚕为载体大量表达外源蛋白,且省时省力,是制备生物活性蛋白的优良选择。狂犬病毒（Rabies Virus,RV）M基因ORF为609个核苷酸,编码202个氨基酸残基的基质蛋白,分子量约25 KD,其在子代病毒的装配、出芽和形态形成中起重要作用。本研究利用BmNPV Bac-to-Bac表达系统表达了重组的RVM（rRV-M）蛋白,将纯化的rRV-M蛋白作为抗原免疫小鼠,对制备出的血清抗体进行间接ELISA效价测定。本研究结果可以为RVM蛋白的功能探索提供抗原和抗体来源,也能为家蚕生物反应器的开发利用提供参考。研究的具体内容及结果如下:1、通过将RV M基因的ORF定向克隆到供体质粒pFastBacHTA上,构建重组供体质粒pFastBacHTA-M;然后转化至含有BmNPV Bacmid的大肠杆菌DH10BmBac,在辅助载体表达的转座酶作用下,RVM基因转座并插入到Bacmid DNA中,由多角体蛋白基因启动子控制其转录与表达。最后将重组杆粒rBacmid-M与脂质体混合注射五龄起蚕,得到重组杆状病毒rBmNPV-M。2、采集rBmNPV-M病毒感染的家蚕血淋巴细胞进行间接免疫荧光试验,结果显示,rBmNPV-M感染的血淋巴细胞发出特异性的亮绿色荧光,荧光集中分布在细胞质膜周围。对家蚕的血淋巴和脂肪体进行Western-blot试验,鉴定rRV-M蛋白在蚕体内的表达情况,结果显示,rRV-M蛋白在家蚕体内获得大量表达,重组蛋白的相对分子量约为25 KD。3、通过镍离子亲和层析从蚕体中纯化表达的rRV-M蛋白,纯化的蛋白条带单一,纯度良好。纯化的rRV-M蛋白与弗氏佐剂混合,以此为抗原免疫小鼠并分离血清得到多克隆抗体,对血清抗体进行间接ELISA效价测定,效价为1:2560。
曹蕾菥[6]（2017）在《AcMNPV凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能研究》文中提出IAPs,统称为凋亡抑制因子（Inhibitors of apoptosis）,最初在杆状病毒中作为一类抗凋亡蛋白被发现,之后在其他物种（如哺乳动物,果蝇,线虫等）中也发现了它们的身影。在杆状病毒中,IAPs是调控宿主细胞凋亡进程的一大类蛋白,目前根据其氨基酸序列的同源性将其分为六类（IAP1-6）。各类IAPs的结构相似,功能却不尽相同,有些IAP有促凋亡活性。宿主通过启动其凋亡程序来抗病毒感染,而病毒又通过抑制细胞凋亡,来促进其自身的增殖传播。为明确IAPs在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）抗虫过程中的作用机制,我们开展了Ac-IAPs的功能研究,并在此基础上,探讨了Ac-IAP1/2对重组病毒AcMNPV-BmK IT（P10）细胞毒性的协同效应。本研究分为三部分:第一部分:凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能分析。我们首先利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-IAP1/2的重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp。然后分别用1 MOI的重组病毒AcMNPV--iap1/2-egfp感染Sf9细胞,荧光显微镜观察与Western blot分析结果表明,Ac-IAP1/2-EGFP的表达量随着感染时间的延长而逐渐增加,并在120 h达到最大。接着,分别用0.001 MOI的野生病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp感染Sf9细胞1-4天,蚀斑实验检测不同处理组细胞和培养液中子代病毒粒子的数量,结果表明AcMNPV-iap2-egfp促进子代病毒增殖;而AcMNPV-iap1-egfp抑制子代病毒增殖,表明Ac-IAP2可促进子代病毒增殖,而Ac-IAP1则执行相反的功能。之后,分别用1.5-12 MOI的AcMNPV和AcMNPV-iap1/2-egfp感染Sf9细胞48 h,MTT试剂检测Sf9细胞的增殖情况,结果表明AcMNPV-iap2-egfp以剂量-依赖的形式促进细胞增殖;AcMNPV-iap1-egfp无论在正常条件还是营养胁迫条件下,均显着抑制细胞增殖。这表明Ac-IAP1具有诱导细胞凋亡的活性,Ac-IAP2则可促进细胞增殖。在抗虫实验中,分别用20μL,1×107 pfu/mL的AcMNPV-egfp和AcMNPV-iap1/2-egfp连续饲喂三龄期棉铃虫幼虫五天,检测棉铃幼虫的生长情况、死亡率及蛹化率。结果表明,由AcMNPV-iap2-egfp饲喂的棉铃虫,不仅生长缓慢,死亡率也远高于其他两个病毒处理组。而AcMNPV-iap1-egfp饲喂的棉铃虫,死亡率和化蛹率与野生荧光标签病毒AcMNPV-egfp处理组相差无几,表明Ac-IAP1尽管表现出较强的细胞毒性,但过表达Ac-IAP1的病毒AcMNPV-iap1-egfp的杀虫效果不佳,而AcMNPV-iap2-egfp则具有较高抗虫活性。第二部分:BIR2结构域对于Ac-IAP2的抗凋亡功能至关重要。采用GenBank和PDB数据库检索Ac-IAP1/2的功能域,DNAMAN软件比对分析并确定Ac-IAP1/2间序列差异较大的功能域为BIR2结构域。我们通过重叠PCR技术将Ac-IAP2的BIR2结构域置换为Ac-IAP1的BIR2结构域,并用Bac-to-Bac昆虫表达系统构建了过表达Ac-IAP2突变体Ac-IAP2-BIR2（iap1）的重组病毒AcMNPV--iap2-BIR2（iap1）-egfp。然后,用1 MOI的AcMNPV-iap2-BIR2（iap1）-egfp感染Sf9细胞,荧光显微镜观察与Western blot结果表明,随着感染时间的延长,被感染的细胞（即带绿色荧光的细胞）显着增多、细胞的荧光强度显着增强,Ac-IAP2-BIR2（iap1）-EGFP的表达量增加,并在120 h达到最大。接着,分别用3-12 MOI的AcMNPV-iap1/2-egfp和AcMNPV-iap2-BIR2（iap1）-egfp感染Sf9细胞48 h,MTT试剂检测Sf9细胞的增殖情况,结果表明,与AcMNPV-iap2-egfp仅差一个BIR2功能域的AcMNPV-iap2-BIR2（iap1）-egfp却具有比AcMNPV-iap1-egfp更高的细胞增殖抑制率。这表明Ac-IAP2-BIR2（iap1）促进细胞凋亡,BIR2结构域对于Ac-IAP2的抗凋亡功能至关重要。第三部分:Ac-IAP1/2对重组病毒AcMNPV-BmK IT（P10）促凋亡活性的协同效应分析。前两部分实验已经对Ac-IAP1/2的功能作了分析,那么作为调控宿主细胞凋亡的两个重要因子,它们是否可提高我们已有的重组蝎昆虫特异性毒素（BmK IT）的AcMNPV-BmK IT的细胞毒性?鉴于我们前期的研究,早期启动子（IE1）调控表达的BmK IT在病毒感染早期可促进子代病毒增殖,而早期（IE1）和晚期启动子（P10）调控表达的BmK IT均可促进细胞凋亡。本节中,我们首先分析了晚期启动子（P10）调控表达的BmK IT对子代病毒增殖的影响。分别用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV--BmK IT（P10）侵染Sf9细胞,结果显示在16-48 h内,AcMNPV-BmK IT（P10）处理组细胞中的病毒粒子积累量均低于野生病毒处理组,表明AcMNPV-BmK IT（P10）可抑制子代病毒在宿主细胞内的累积。接着,用1 MOI的AcMNPV-BmK IT（P10）侵染Sf9细胞,Real-time PCR结果表明,BmK IT的转录水平在病毒感染24 h后,呈减弱趋势。而在病毒感染48 h时宿主细胞内的子代病毒粒子积累量有一个轻微的增长,这表明BmK IT是抑制宿主细胞内子代病毒粒子积累的原因;之后,用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV-BmK IT（P10）侵染Sf9细胞,Real-time PCR结果表明在病毒感染早期AcMNPV-BmK IT（P10）处理组中vp39基因的转录水平高于野生病毒处理组,而感染晚期与之相反。上述结果共同表明P10启动子调控表达的BmK IT,在病毒感染早期,促进子代病毒增殖和出芽,而在感染晚期促进细胞凋亡、抑制子代病毒的增殖,利于子代病毒传播。接着,分别用10 MOI的AcMNPV和AcMNPV-Bm K IT（P10）侵染Sf9细胞,DAPI荧光染色结果显示,两病毒处理组的细胞核形态和大小没有明显差异,表明重组病毒AcMNPV-BmK IT（P10）对子代病毒增殖和出芽的影响,并不依赖存在于细胞核中病毒发生基质的形成。在明确了AcMNPV-BmK IT（P10）在宿主细胞内增殖的规律后,我们检测了Ac-IAP1/2对重组病毒AcMNPV-BmK IT（P10）促细胞凋亡活性的协同效应,分别用AcMNPV-iap1/2-egfp（3 MOI）与AcMNPV-BmK IT（P10）（1.5、3和6 MOI）共侵染Sf9细胞,结果表明,Ac-IAP1可协同AcMNPV-BmK IT（P10）促进宿主细胞凋亡,且其细胞毒性高于BmK IT;Ac-IAP2通过抑制细胞凋亡为BmK IT促进子代病毒增殖争取了时间,使得子代病毒大量增殖,从而提高了AcMNPV-BmK IT（P10）的细胞毒性。本研究分别在虫体和细胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中调控宿主凋亡的关键因子Ac-IAP1/2的功能,明确了BIR2结构域对Ac-IAP2抗凋亡功能的重要性,获得了一株抗虫效率较高的病毒杀虫剂AcMNPV-iap2-egfp,并进一步完善了AcMNPV-BmK IT（P10）细胞毒性机制及IAPs对其协同效应的研究。本研究为杆状病毒IAPs的机制研究及应用提供了实验依据,对科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。
李星[7]（2016）在《AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的抗虫机制研究》文中指出杆状病毒（baculovirus）是一类含双链环状超螺旋DNA分子（约82-180 kbp）的病毒,因其病毒粒子呈长杆状而得名,其宿主主要是鳞翅目、膜翅目、双翅目昆虫。作为杆状病毒模式种的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）的DNA分子约为130 kbp,含有开放阅读框150多个。与化学农药相比,AcMNPV具有杀虫率高,对人、畜安全,不易产生抗药性等特点,但杀虫速度慢、杀虫效率低限制了AcMNPV的广泛应用。东亚钳蝎昆虫毒素BmK IT是一种兴奋型昆虫特异性毒素,包含69个氨基酸残基,作用于昆虫细胞膜上钠离子通道,导致昆虫兴奋型麻痹。相关研究表明,将蝎昆虫特异性毒素基因重组进AcMNPV基因组能够提高AcMNPV杀虫效率。本实验基于前期对BmK IT提高AcMNPV抗虫活性的研究,进一步揭示AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对昆虫Sf9细胞和棉铃虫体的作用机制。本研究分为三部分内容:第一部分:分析了AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53表达及核内聚集的影响。前期我们表达纯化了P53蛋白,并制备了其多克隆抗体。用终浓度为2.28×1012 vp/mL（10 MOI）的野生型病毒AcMNPV和重组病毒AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（P10）、AcMNPV-BmK IT（PH）感染细胞6-45 h,Western blot检测到AcMNPV、AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（P10）、AcMNPV-BmK IT（PH）处理组分别在21、12、27、27h时P53表达量出现明显增加,推测细胞内P53表达受外源BmK IT表达水平的影响;接着,分别用AcMNPV、AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）感染Sf9细胞21、12、27、27h,免疫荧光法检测P53在细胞核内的聚集情况,结果表明AcMNPV、AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）处理组P53在细胞核的聚集量依次增高,由此推测重组病毒能够通过P53促进细胞凋亡。以上实验结果说明三种启动子调控BmK IT表达存在时间上差异,进而影响细胞内P53表达水平及向核内聚集的程度,加速细胞凋亡进程。第二部分:分析了AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞肌动蛋白重排的影响。用终浓度为2.28×1012 vp/mL（10MOI）的AcMNPV、AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）感染Sf9细胞6-46 h,结果表明,细胞感染病毒6-21 h时,四组病毒处理的细胞内的肌动蛋白在细胞膜附近聚集,于细胞内表面形成聚集物,随着时间的推移凝聚物逐渐增加,随后肌动蛋白逐渐向细胞核内聚集。在病毒侵染37h后,AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）处理组细胞核内肌动蛋白的量明显减少;在病毒侵染46h后,AcMNPV-BmK IT（IE1）处理组细胞核内肌动蛋白的量明显减少。Western blot检测结果与免疫荧光观察结果一致,即不同启动子调控表达BmK IT的重组病毒感染细胞后,均会推迟肌动蛋白向核内聚集,加快肌动蛋白出核。我们推测这种变化是由于BmK IT能够作用于细胞膜上钠离子通道,进而改变细胞内微环境,促进了细胞内凋亡相关蛋白的表达,重组病毒为适应这一变化,通过调控肌动蛋白的重排来调整其增殖的进度。第三部分:分析了AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫体侵染的机制。分别用终浓度为3.16×108 PIBs/mL的AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）侵染棉铃虫1h、4h、8h、12h。RT-PCR检测到在中肠组织中,三个处理组BmK IT表达量分别在4h、8h、12h时达到最大值,并且AcMNPV-BmK IT（P10）处理组BmK IT最高表达量分别是AcMNPV-BmK IT（IE1）、AcMNPV-BmK IT（PH）处理组的1.4倍和3.2倍。RT-PCR检测到在表皮组织中,AcMNPV-BmK IT（IE1）处理组BmK IT表达量较低,推测为出芽型病毒直接侵染的结果,而在AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）处理组中,BmK IT表达量分别在8h、12h达到最大值。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记法（TUNEL）检测AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的重组病毒侵染棉铃虫后肠组织细胞凋亡情况,表明四个处理组中肠组织细胞均发生不同程度的凋亡。棉铃虫体内酚氧化酶活性测定表明,AcMNPV-BmK IT（IE1）处理组虫体酚氧化酶活性在4 h达到最大值,分别是AcMNPV,AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）处理组的1.45倍、1.19倍、1.32倍。AcMNPV-BmK IT（P10）处理组和AcMNPV-BmK IT（PH）处理组酚氧化酶活性在8 h达到最大值,并且AcMNPV-BmK IT（PH）处理组酚氧化酶活性高于AcMNPV-BmK IT（P10）处理组。Western blot检测了早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫中肠组织细胞P53表达的影响,结果表明AcMNPV-BmK IT（IE1）处理组在4 h时,凋亡蛋白P53在中肠组织细胞的表达量达到最大值,而AcMNPV-BmK IT（P10）和AcMNPV-BmK IT（PH）处理组在8 h时凋亡蛋白P53在中肠组织细胞的表达量达到最大值,推测在虫体水平,BmK IT可通过P53蛋白介导组织细胞凋亡。以上实验分别在细胞和虫体水平分析了 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的控害机制,研究结果在为杆状病毒感染鳞翅目害虫提供可寻的普遍规律的同时,揭示出重组病毒AcMNPV-BmK IT的潜在机制,为有效改造利用AcMNPV和科学生物控害提供了依据。
蒋亮[8]（2013）在《基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）抗性素材创新及抗性机制研究》文中认为家蚕是一种具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,但面临严重的疾病威胁。家蚕核型多角体病毒（B. mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是对养蚕业危害最严重的一类病原,经常给蚕业生产带来严重经济损失。传统消毒方法可以在一定程度上预防蚕病,但具有很大局限性。培育抗性品种是应对蚕病威胁的有效手段,本研究利用转基因技术培育抗BmNPV的家蚕品种。首先,建立了家蚕抗性检测平台；接着,根据BmNPV的侵染过程,选择不同靶标基因,分别在侵染的四个关键环节对其进行抑制；然后,对四种不同抗病毒策略进行优化和整合,进一步提高家蚕抗性；最后,对蚕业生产现行实用品种进行大规模转基因改良。主要获得以下的研究成果：1.家蚕抗性检测平台的建立在制定BmNPV病原的制备标准、桑叶的切割标准、病原的单头添食标准和调查记录标准的基础上,建立了家蚕抗性检测平台。具体操作为：取具有BmNPV感染典型症状的病蚕血液,经创伤感染大批健康5龄起蚕,在其开始出现感染典型症状时收集血液,纯化获得大量BmNPV病毒；将新鲜桑叶切割成标准规格的小片并摆放整齐；准确吸取等量的病毒溶液滴在每片叶块上,涂抹均匀后晾干,将饥饿处理后的起蚕小心地放到涂抹有病毒的桑叶上,一片桑叶对应一头蚕；给桑后2h左右,选择将整片涂有病毒的桑叶食下的个体作为后续检测的对象,并按重复区分区饲养；将饲养过程中出现疑似病征的蚕及时捡出,放置在另一个干净塑料盒中继续观察,确定其是否发病,做好调查记录。标准化的BmNPV病毒提纯流程,能有效避免其他病原的污染,从而确保病蚕表型的可靠性；单头添食保证每头蚕食下病原量一致,避免因个体食下病原量不同给实验结果带来的影响；及时分离可疑病蚕,可有效避免二次感染,保证数据的可靠性。该检测平台具有的这些优点,提高了检测结果的真实性、可靠性和可重复性。2.增量表达内源基因Bmlipase-1在感染初期抑制BmNPV提高转基因家蚕抗性Bmlipase-1蛋白具有强烈的抗病毒能力,在BmNPV感染早期发挥抑制作用。在之前的研究中,本实验室已经制备出利用BmNPV IE1启动子（IE1P）介导内源抗性基因Bmlipase-1增量表达的转基因系统LI。本研究对LI进行了系统检测。Southern blot和反向PCR结果表明外源片段以单拷贝方式插入在家蚕基因组的基因间区；qPCR检测结果显示,LI-A四龄中肠的Bmlipase-1表达量比正常大造（NmDZ）高27.3%；Western blot检测结果显示,在四、五龄起蚕肠液中,LI-A的Bmlipase-1蛋白含量明显高于Nm DZ；抗性检测结果显示,当四龄起蚕以106个头经口食下感染BmNPV以后,LI-A的死亡率比Nm DZ低33%；qPCR结果显示,LI-A中的病毒DNA拷贝数只有Nm DZ的37%左右；幼虫体重变化调查结果显示,LI-A幼虫的生长发育未受到影响；经济性状调查结果显示,LI-A和Nm DZ之间的全茧量和茧层率都没有明显区别。以上结果表明,增量表达Bmlipase-1可以显着提高家蚕的抗性而不影响其经济性状。3.干涉BmNPV基因在mRNA水平抑制病毒提高转基因家蚕抗性RNAi是一种有效的抗病毒策略,干涉BmNPV基因可以在mRNA转录水平抑制病毒的增殖。某些因素会影响转基因干涉家蚕的抗病毒能力,本论文对这些因素进行了系统比较和分析。转基因干涉载体包括启动子、靶标基因正向片段、间隔序列、靶标基因反向片段和终止信号序列。基因正反向片段与间隔序列的连接模式包括“头对头”和“尾对尾”,本论文制备了IE1P介导iel dsRNA和A4P介导gp64dsRNA分别以“头对头”和“尾对尾”模式表达的转基因系统,检测结果表明,在感染BmNPV以后,使用“头对头”模式的转基因家蚕体内靶标基因mRNA量更低、病毒DNA含量更少、抗性更高。启动子对转基因干涉效率具有重要影响,本研究构建了IE1P、IE1P＋hr3和A4P3个不同启动子分别介导gp64dsRNA表达的转基因家蚕,检测结果显示,使用IE1P＋hr3的转基因家蚕在感染病毒以后的gp64mRNA量最低、病毒DNA含量最少、死亡率最低。靶标基因的选择也会影响转基因干涉效率,BmNPV包括必需基因和非必需基因,同时又可以分为极早期、晚早期、晚期和极晚期基因,本论文选择极早期必需基因ie-1、晚早期必需基因helicase、晚期必需基因gp64和vp39及极早期非必需基因ie-2作为靶标进行比较,结果显示干涉必需基因对病毒增殖的抑制效果更好,在不同时期的靶标基因中,极早期基因是最好的干涉靶标。这些结果显示,利用IE1P＋hr3介导病毒极早期必需基因dsRNA以“头对头”模式表达可以制备出抗性更好的转基因家蚕。4.增量表达外源基因hycu-ep32在蛋白合成水平抑制BmNPV提高转基因家蚕抗性HycuNPV的hycu-ep32基因在共感染细胞系中通过抑制总蛋白合成来抑制BmNPV的增殖。为了确定其能否在家蚕个体中抑制BmNPV的增殖,本研究制备了诱导型启动子（39KP）、增强子+诱导型启动子（hr3＋39KP）、组成型启动子（A4P）和增强子+组成型启动子（hr3+A4P）分别介导hycu-ep32增量表达的转基因家蚕EKG、HEKG、EAG和HEAG。RT-PCR结果显示,hycu-ep32在这些转基因家蚕中成功表达,在HEKG-B中的表达量最高；抗性检测结果表明,HEKG和HEAG具有显着提高的抗BmNPV能力,HEKG-B的抗性最好；qPCR结果显示,不管是否感染BmNPV, hycu-ep32在HEKG-B中的表达量都是最高,表明转基因家蚕的hycu-ep32转录量越高,其对BmNPV的抗性越好；hr3在正常转基因家蚕幼虫中可以显着增强39KP的转录活性,而在感染BmNPV以后可以显着增强39KP和A4P的转录活性；qPCR结果显示,所有检测转基因系统体内的病毒含量都显着低于对照,表明BmNPV的增殖受到抑制。跟我们预期的一样,39KP＋hr3是所有被检测启动子中最好的一个,HEKG-B的hycu-ep32表达量在正常状态下比较低,但在感染BmNPV后随着病毒量的增加而显着增加,从而使家蚕对BmNPV的抗性显着提高,而且经济性状没有受到影响。5.干涉BmPGRP2激活宿主先天免疫反应提高转基因家蚕对BmNPV的抗性肽聚糖识别蛋白（PGRP）是昆虫的主要模式识别受体之一,具有激活体液免疫信号通路、参与酚氧化酶原级联反应等功能。基于基因组生物信息学和芯片数据分析,本研究克隆了家蚕BmPGRP2基因,发现其具有两种选择性拼接形式BmPGRP2和BmPGRP2a,这是首次克隆到具有选择性拼接的家蚕模式识别受体基因。BmPGRP2a具有一个包含了BmPGRP25’UTR的长5’UTR,说明这两种拼接形式很可能是由不同转录起始位点引起的。亚细胞定位结果显示,BmPGRP2蛋白分布于整个细胞,而BmPGRP2a只定位在细胞膜；时期表达模式检测结果表明,BmPGRP2a在家蚕幼虫阶段的表达量低于BmPGRP2,但在卵期、蛹期和蛾期高于BmPGRP2;组织表达模式检测结果显示,BmPGRP2和BmPGRP2a在雌蚕组织中的表达量高于雄蚕组织,在中肠的表达量都是最低的,BmPGRP2的表达量在中肠低于BmPGRP2a,而在其他组织高于BmPGRP2a。BmPGRP2基因具有不同选择性拼接形式、定位在胞内（或膜上）,表明其属于PGRP-L亚家族。BmPGRP2和BmPGRP2a这两种不同拼接形式的亚细胞定位和时空表达模式不同,暗示它们可能行使不同功能。在NCBI进行blast比对,没有发现与BmPGRP2目似的基因,说明这是一个新基因；进化分析发现它单独聚为一枝,暗示它的功能可能与其他已知基因不同。品种比较分析发现,BmPGRP2和家蚕的抗病毒能力有一定关系,在抗性高的蚕品系中,BmPGRP2的表达量低。为了探究降低BmPGRP2表达量是否可以提高家蚕抗性,本实验利用家蚕932品种制备了干涉BmPGRP2的转基因家蚕PGRP2I。qPCR结果显示,转基因家蚕的BmPGRP2表达量显着下调；抗性检测结果表明,转基因系统的抗性显着提高,PGRP2I-2感染BmNPV以后的死亡率比932低30%以上；qPCR结果显示,PGRP2I-2可以显着抑制BmNPV的复制增殖,其病毒DNA含量仅为对照的45%左右；全茧量和茧层率调查结果显示,干涉BmPGRP2没有影响家蚕的经济性状。这些结果表明,BmPGRP2参与了家蚕对病毒的先天免疫反应,可以通过降低家蚕体内的BmPGRP2表达量来提高家蚕抗性。在感染BmNPV以后,正常家蚕体内的BmPGRP2被诱导上调表达,而Imd和Toll通路的基因没有被诱导。在转基因干涉家蚕PGRP2I-2中,虽然BmPGRP2也被BmNPV诱导上调,但其上调后的表达量和932正常状态下的表达量没有显着差异,导致Bmlmd（?）BmPelle被诱导显着上调。这些结果表明,干涉BmPGRP2使家蚕的某条免疫信号通路在感染BmNPV后被激活。在PGRP2I-2中,Imd和Toll通路的其他基因在感染BmNPV以后没有被诱导上调,暗示Bmlmd和BmPelle参与的这个免疫信号通路有可能是一个新的通路。6.不同抗病毒策略的优化和整合增量表达Bmlipase-1、干涉病毒基因、增量表达hycu-ep32、干涉BmPGRP2,可以分别在病毒侵染早期、病毒mRNA转录水平、病毒蛋白合成水平、调控宿主先天免疫防御等四个方面抑制BmNPV增殖并提高家蚕抗性。为了进一步提高家蚕的抗性,本论文对这四种策略进行了优化和整合。利用IE1Pie1H-B、HEKG-B和PGRP2I-2的纯合个体分别进行杂交,抗性检测结果显示,两两杂交后代的抗性没有显着高于纯合亲本。所以,本论文构建了改进型转基因载体pb-HFPL,在hr3增强子的作用下,IE1P介导iel、gp64、lefl、lef2和DNA polymerase等5个病毒基因的串联干涉,家蚕中肠特异启动子P2介导Bmlipase-1的增量表达；通过注射实用品种芙蓉（SW）制备了转基因系统SW-H。qPCR结果显示,在3龄起蚕整蚕和5龄起蚕中肠,SW-H的Bmlipase-1表达量分别比非转基因SW高40%和90%左右,SW-H的Bmlipase-1表达量显着提高,表明其可以在感染初期抑制病毒。在3龄起蚕以5×105个／头经口添食感染BmNPV后,SW-H体内ie-1和gp64的mRNA量分别为SW的17%和25%左右,显示SW-H体内的病毒mRNA量被显着降低,表明其通过干涉病毒基因能够在增殖阶段抑制病毒；SW-H体内的病毒含量不到SW的20%,表明转基因系统显着抑制了病毒的复制增殖；SW-H1的存活率比SW高78%,表明转基因系统的抗性显着提高。SW-H的抗性显着提高而经济性状没有受到影响,说明可以通过同时增量表达抗性基因和干涉病毒基因来进一步提高家蚕的抗性。SW-H是第一个能在感染的多个阶段抑制病毒的转基因高抗病毒动物。进而,本论文构建了一个整合四种抗病毒策略的转基因载体pb-KNT,在hr3作用下,利用39KP介导hycu-ep32的增量表达,利用IE1P介导BmPGRP2和4个病毒基因ie-1、gp64、helicase、lef-1的串联干涉,利用P2介导Bmlipase-1的增量表达。利用pb-KNT载体制备的转基因家蚕将在BmNPV侵染的四个不同阶段同时抑制病毒,有望培育出高抗BmNPV的转基因家蚕品种。7.蚕业生产现行实用品种的转基因改良和安全思考为了将基础研究成果向应用成果进行转化,本论文选取重庆、四川、广东、广西等蚕业主产区使用范围比较广的家蚕品种“苍海·日月”、“781×7532"、“夏芳·秋白”、“两广二号”等进行第一批转基因改良,在显微注射pb-HFPL载体后,成功制备了大部分品种的转基因品系。利用pb-KNT载体对蚕业生产现行实用品种进行大规模转基因改良,培育高抗BmNPV的转基因家蚕品种的工作也正在进行中。家蚕是完全驯化动物,只能在室内饲养,而且在长期的养蚕历史中没有不安全的记录。因此,家蚕的安全等级可能为Ⅰ,转基因家蚕及其产品的安全等级也可能为Ⅰ。为了评估转基因家蚕的安全性,按照农业部转基因生物安全管理条例的要求,本实验室目前正在申请对IE1Pie1H-B、HEKG-B、PGRP2I-2等基础抗性素材和以SW-H为代表的改进型抗性品系进行安全检测中间试验。我们将严格按照国家法律法规的要求,对这些转基因品系进行严格的检测和评价,争取早日取得转基因抗性品种的安全证书并将其应用于蚕业生产。
唐琦[9]（2013）在《可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析》文中进行了进一步梳理家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境,因而已经逐渐取代传统的化学农药,广泛应用于农林防护。目前,越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知,对这些未知功能的基因进行研究,有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论,从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因,构建重组型的杆状病毒,从而更好地利用杆状病毒表达系统,或作为生物杀虫剂防治农林害虫。本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因（Bm65）和晚期基因（Bm91）为研究对象,分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒,进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下：一.Bm65基因功能1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游,预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基,理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示,Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族,推测该基因可能与病毒DNA复制有关。2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白,制备了抗血清。此外,利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白,为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h.5’RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。4.利用Red重组系统,用Cm基因成功地取代了Bm65后,通过抗性筛选得到缺失型病毒,并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因,但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。二.Bm91基因功能1.Bm91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白,在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处,预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示,Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族,推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。2.原核表达Bm91蛋白,制备多克隆抗体。转录分析表明,Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录,一直持续到感染后96h,且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。3.成功构建了Bm91缺失型病毒,通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现,Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生,且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比,滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LD50,却使得宿主幼虫的半数致死时间LT5o延长了24h,提示Bm91为病毒增殖的非必需基因,但该基因可能与病毒毒力有关。以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况,为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础,也为该病毒的改造和利用提供理论依据。
刘惠芬[10]（2012）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA复制原点及ORF63基因分析》文中研究说明斜纹夜蛾（Spodoptera litura）属鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性的重要农林害虫，寄主植物达100多科300余种。由于斜纹夜蛾的食性杂、繁殖能力强、抗性强，因此防治难度高。在各种化学合成杀虫剂严重污染环境以及害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下，生物防治愈显重要和迫切。昆虫杆状病毒由于其宿主单一，致死能力强，对环境没有危害等优点，成为了良好的生物防治武器。斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株（SpltNPVⅡ）是近年来新发现的一种繁殖率和毒力极强的新的病毒变异株，该病毒株的基因组全序列已经测定完成，包含149个开放读码框。但病毒基因组的复制机制和基因功能并不清楚，本研究对SpltMNPVⅡ的基因组DNA的复制原点进行了研究，并对新型未知基因ORF63进行序列分析、克隆表达及多抗制备的基础上，进一步从启动子活性，转录时相、表达时相，亚细胞定位等方面，研究该基因的基本特征及其功能，旨在丰富杆状病毒分子生物学，为杆状病毒的遗传改良、研制更有效的基因工程载体和病毒杀虫剂提供理论基础。主要研究结果如下：1.利用生物软件对SpltMNPVⅡ基因组DNA序列进行分析，确定了7个同源重复区（hrs）的结构特征，分别包含3-8个数目不等的64bp不完全回文序列，回文基序的中心均含有一个PvuI限制性酶切位点，并且存在多个正向或反向互补的重复序列和与病毒基因组DNA复制相关的motif基序，对7个hrs中40个回文序列进行比对分析，发现其序列的核苷酸一致性高达90%以上。2.构建检测7个hrs复制、增强功能的质粒，利用脂质体介导的功能质粒在Spli221细胞系中的转染与瞬时表达实验和实时荧光定量PCR，确定了SpltNPVⅡ的7个hrs均具有基因组DNA复制起始点和增强子的双功能作用，但复制增强能力大小不一。其中hr5的复制效率最低（1.52×105copies/μg DNA），hr4的复制效率最高（4.88×106copies/μg DNA）；hr1和hr7在病毒感染的细胞中对于ie-1启动子控制下的luc基因的瞬时表达有极大的增强作用，增强效率可达11.83和13.16倍，而hr5的增强作用最小，增强效率仅为3倍左右，其余四个同源重复区的增强效率分别在6到9倍之间。3.对单一64bp不完全回文序列进行剖析，实时荧光定量PCR检测显示单一64bp的回文序列不具有复制功能；瞬时表达实验表明64bp的回文序列没有显着提高ie-1启动子的转录活性。利用Spearman分析了7个hrs的复制效率，增强效率和不完全回文序列和其他特征序列数目的相关性，结果表明SpltNPVⅡ中7个hrs的复制效率和增强能力均与顺式作用元件中的回文序列、重复序列和特征序列具有显着正相关；复制效率与重复序列的相关性最强，增强能力与特征序列相关性最强；复制效率与增强能力无显着相关性。4.对SpltMNPVⅡORF63基因结构进行了分析。ORF63基因全长1071bp，编码356aa，预测蛋白分子量为41.3kDa，该基因既有早期启动子基序CAGT，又有晚期启动子基序TAAG。对SpltMNPVⅡORF63基因的启动子活性和转录时相进行分析，发现该基因是在病毒生命周期的早期和晚期都有转录的基因。5.对SpltMNPVⅡORF63基因的部分序列进行了原核表达，表达产物经纯化和质谱鉴定后，免疫豚鼠制作了多克隆抗体。抗体效价用ELISA进行测定，该基因的表达产物制作的抗体效价在1∶3200以上。以制备的多克隆抗体为一抗，对ORF63基因在宿主细胞的表达产物进行了表达时相分析，ORF63基因产物最早在病毒感染细胞后4h出现，最早在感染虫体后8h出现，并且后期都有表达，说明该基因是早期和晚期均表达的基因，与其启动子分析和转录时相分析结果一致。6.利用免疫荧光细胞化学实验对SpltMNPVⅡORF63基因进行亚细胞定位，结果表明感染Spli221细胞24h后，在细胞质和细胞核中都能检测到ORF63基因的表达产物；到感染48h，ORF63基因产物主要分布在被感染宿主的细胞质膜上。
二、棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)（论文提纲范文）
（2）苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果蠹蛾的发生与分布 |
| 1.2 苹果蠹蛾的生物防治方法 |
| 1.3 苹果蠹蛾颗粒体病毒分类状地位和组织病理学 |
| 1.4 苹果蠹蛾颗粒病田间应用 |
| 1.5 苹果蠹蛾颗粒体病毒的田间抗性发生 |
| 1.6 Illumina第二代测序在杆状病毒中的应用 |
| 1.7 CpGV紫外线保护剂 |
| 1.8.热休克蛋白70 |
| 1.9 .研究依据、目的和意义 |
| 第二章 七个苹果蠹蛾颗粒体病毒的毒力差异和多样性 |
| 2.2 引言 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 待试昆虫 |
| 2.3.2 病毒扩繁 |
| 2.3.3 毒力测定 |
| 2.3.4 Cp GV分离株中pe38 基因序列比较 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 CpGV分离株的毒力差异 |
| 2.4.2 Pe38基因PCR产物分析 |
| 2.4.3 多重序列比对pe38基因扩增片段 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 七个苹果蠹蛾颗粒体病毒的遗传构成 |
| 3.2 引言 |
| 3.3 材料和方法 |
| 3.3.1 CpGV分离株及扩繁 |
| 3.3.2 基因组测序和组装 |
| 3.3.3 系统发育分析 |
| 3.3.4 单核苷酸多态性分析 |
| 3.4 结果和讨论 |
| 3.4.1 基因组组装和系统发育 |
| 3.4.2 基因组注释和比较 |
| 3.4.3 Pe38基因重复序列多态性 |
| 3.4.4 SNP分类和Cp GV分离株基因组组成 |
| 第四章 苹果蠹蛾颗粒体病毒紫外线保护剂的研究 |
| 4.2 引言 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 供试虫源、Cp GV-ZY及氧化铁 |
| 4.3.2 试验方法 |
| 4.3.2.1 氧化铁对苹果蠹蛾幼虫死亡率影响 |
| 4.3.2.2 不同浓度氧化铁混合Cp GV-ZY后进行UVB照射处理 |
| 4.3.2.3 不同浓度氧化铁混合Cp GV-ZY后进行自然光处理 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 氧化铁对苹果蠹蛾幼虫死亡率影响 |
| 4.4.2 不同浓度氧化铁对Cp GV-ZY免受UVB辐射损害的效果 |
| 4.4.3 不同浓度氧化铁对Cp GV-ZY免受强日照辐射损害的效果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 感染不同Cp GVs的苹果蠹蛾hsp70s转录水平差异 |
| 5.2 引言 |
| 5.3 材料与方法 |
| 5.3.1 昆虫与病毒 |
| 5.3.2 半致死剂量(LD50)测定 |
| 5.3.3 收集RT-PCR的样品 |
| 5.3.4 测定苹果蠹蛾热休克蛋白转录水平 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 半致死剂量(LD50) |
| 5.4.2 定量热休克蛋白70转录水平 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论和讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）EoNPV基因组分析及对茶尺蠖两近缘种毒力差异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 杆状病毒的研究概况 |
| 1.1.1 昆虫病毒 |
| 1.1.2 杆状病毒的应用 |
| 1.1.3 杆状病毒基因组的研究进展 |
| 1.2 茶树害虫病毒的研究进展 |
| 1.2.1 茶树害虫病毒的种类与现状 |
| 1.2.2 茶尺蠖核型多角体病毒的研究与应用 |
| 1.3 茶尺蠖两近缘种的发生与防治 |
| 1.3.1 近缘种昆虫的区分方法 |
| 1.3.2 茶尺蠖两近缘种的研究进展 |
| 1.3.3 茶尺蠖两近缘种的危害与防治进展 |
| 1.4 研究目的与内容 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究技术路线 |
| 第二章 EoNPV全基因组序列与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试病毒 |
| 2.1.2 EoNPV病毒DNA的提取 |
| 2.1.3 基因组数据的分析方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 EoNPV的全基因组信息 |
| 2.2.2 EoNPV的结构基因 |
| 2.2.3 转录特异性基因 |
| 2.2.4 DNA复制和修饰基因 |
| 2.2.5 同源重复区域 |
| 2.2.6 EoNPV在杆状病毒中的进化 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源与病毒 |
| 3.1.2 毒力测定试验方法 |
| 3.1.3 毒力测定试验数据统计与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 茶尺蠖两近缘种感染EoNPV后的死亡动态 |
| 3.2.2 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的LD_(50)和LT_(50) |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 EoNPV及其高毒力毒株对灰茶尺蠖的毒力研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试虫源与病毒 |
| 4.1.2 毒力测定试验方法 |
| 4.1.3 毒力测定试验数据统计与分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 灰茶尺蠖(YQ)感染EoNPV两毒株后的死亡动态 |
| 4.2.2 灰茶尺蠖(GX)感染EoNPV两毒株后的死亡动态 |
| 4.2.3 EoNPV两毒株对灰茶尺蠖的LD_(50)和LT_(50) |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 茶尺蠖核型多角体病毒的基因组信息 |
| 5.1.2 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异 |
| 5.1.3 高效毒株H-EoNPV及原始毒株EoNPV对灰茶尺蠖的毒力差异 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）家蚕围食膜因子基因Bm011851在幼虫感染BmNPV过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 昆虫杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒的类型 |
| 1.1.2 杆状病毒的生活史 |
| 1.1.3 杆状病毒感染昆虫宿主的途径 |
| 1.2 昆虫围食膜概述 |
| 1.2.1 昆虫围食膜的类型 |
| 1.2.2 昆虫围食膜的组成和结构 |
| 1.2.3 昆虫围食膜的功能 |
| 1.3 外源病原体入侵对昆虫围食膜的影响 |
| 1.3.1 降解围食膜几丁质 |
| 1.3.2 改变围食膜蛋白组分 |
| 1.3.3 破坏围食膜中蛋白质与几丁质的结合 |
| 1.3.4 影响围食膜的其他方式 |
| 1.4 昆虫围食膜因子概述 |
| 1.4.1 围食膜因子的特点 |
| 1.4.2 围食膜因子的分类 |
| 1.4.3 围食膜因子的功能 |
| 1.4.4 围食膜因子基因的研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 目的及意义 |
| 2.3 研究主要内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第3章 家蚕围食膜因子基因Bm011851的克隆及表达分析 |
| 3.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 实验主要试剂配方 |
| 3.1.5 分析工具 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 家蚕幼虫不同时期中肠及不同组织cDNA材料制备 |
| 3.2.2 家蚕围食膜因子基因Bm011851的克隆与表达 |
| 3.2.3 家蚕Bm011851基因的生物信息学分析 |
| 3.2.4 家蚕幼虫食下感染BmNPV后 Bm011851 基因表达 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 家蚕围食膜因子Bm011851的序列特征 |
| 3.3.2 家蚕围食膜因子Bm011851的时空表达 |
| 3.3.3 家蚕幼虫食下感染BmNPV后 Bm011851 基因表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 过表达Bm011851转基因家蚕的获得 |
| 4.1 实验材料及试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 实验主要试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 家蚕围食膜因子Bm011851过表达转基因载体构建 |
| 4.2.2 重组载体显微注射家蚕胚胎 |
| 4.2.3 转基因家蚕阳性个体的筛选 |
| 4.2.4 转基因家蚕阳性个体基因组的提取 |
| 4.2.5 转基因家蚕阳性个体cDNA的获得 |
| 4.2.6 转基因家蚕阳性个体的围食膜因子基因表达 |
| 4.2.7 转基因家蚕阳性个体的经济性状调查 |
| 4.2.8 扫描电镜观察转基因家蚕阳性个体的围食膜表面结构 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 过表达Bm011851转基因家蚕的获得及鉴定 |
| 4.3.2 过表达Bm011851转基因家蚕的主要经济性状 |
| 4.3.3 过表达Bm011851基因对家蚕围食膜表面结构的影响 |
| 4.3.4 过表达Bm011851转基因家蚕中其他围食膜因子基因的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 Bm011851 基因在抵抗BmNPV入侵过程的功能研究 |
| 5.1 实验材料及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 实验主要试剂配方 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 BmNPV的收集及纯化 |
| 5.2.2 转基因家蚕感染BmNPV半致死剂量调查 |
| 5.2.3 转基因家蚕经口感染BmNPV后基因转录分析 |
| 5.2.4 转基因家蚕感染BmNPV后围食膜表面结构观察 |
| 5.2.5 转基因家蚕感染BmNPV后幼虫中肠材料的制备 |
| 5.2.6 家蚕感染BmNPV后中肠组织石蜡切片的材料处理 |
| 5.2.7 中肠组织石蜡切片的制备及染色 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 转基因家蚕经口感染BmNPV后的存活率 |
| 5.3.2 转基因家蚕经口感染BmNPV后半致死剂量 |
| 5.3.3 转基因家蚕经口感染BmNPV后病毒的增值复制 |
| 5.3.4 转基因家蚕经口感染BmNPV后围食膜表面结构变化 |
| 5.3.5 转基因家蚕经口感染BmNPV后家蚕中肠组织细胞变化 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的论文及参加的课题 |
| 致谢 |
（5）利用BmNPV Bac-to-Bac系统在家蚕体内表达狂犬病毒M蛋白及抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 1.前言 |
| 1.1 杆状病毒分类和特点 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 形态结构 |
| 1.1.3 基因组 |
| 1.1.4 基因表达 |
| 1.2 家蚕血液型脓病 |
| 1.2.1 病原 |
| 1.2.2 病征、病变 |
| 1.2.3 感染途径 |
| 1.2.4 防治技术研究 |
| 1.3 家蚕生物反应器 |
| 1.3.1 转基因家蚕生物反应器 |
| 1.3.2 杆状病毒表达系统 |
| 1.3.3 应用领域 |
| 1.4 狂犬病毒M蛋白 |
| 1.4.1 结构 |
| 1.4.2 功能 |
| 1.5 研究目的、意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 实验所用引物 |
| 2.1.4 主要仪器及厂家 |
| 2.1.5 主要试剂及配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组供体质粒的构建 |
| 2.2.2 重组杆粒rBacmid-M的构建 |
| 2.2.3 重组杆杆状病毒rBmNPV-M构建 |
| 2.2.4 重组表达rRV-M蛋白鉴定 |
| 2.2.5 重组rRV-M蛋白的纯化 |
| 2.2.6 免疫小鼠,制备抗体 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 重组供体质粒pFastBacHTA-M的双酶切鉴定 |
| 3.2 重组供体质粒pFastBacHTA-M的PCR鉴定 |
| 3.3 重组杆粒rBacmid-M的蓝白斑筛选 |
| 3.4 重组杆粒rBacmid-M DNA的PCR鉴定 |
| 3.5 重组杆状病毒rBmNPV-M感染家蚕的结果 |
| 3.6 重组表达rRV-M蛋白的鉴定 |
| 3.6.1 间接免疫荧光鉴定表达定位 |
| 3.6.2 SDS-PAGE分析rRV-M蛋白的表达 |
| 3.6.3 Western blot鉴定 |
| 3.7 重组rRV-M蛋白的纯化 |
| 3.8 多克隆抗体效价测定 |
| 4 讨论和结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）AcMNPV凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.2 杆状病毒分类 |
| 1.1.3 杆状病毒的发育循环及形态结构 |
| 1.1.4 杆状病毒的核心基因和主要的结构蛋白 |
| 1.1.5 杆状病毒的启动子 |
| 1.1.6 杆状病毒杀虫剂的研究进展 |
| 1.2 凋亡抑制因子(Inhibitors of apoptosis，IAPs) |
| 1.2.1 凋亡抑制因子的发现 |
| 1.2.2 凋亡抑制因子特征和分类 |
| 1.2.3 凋亡抑制因子IAPs的抗凋亡机制 |
| 1.3 蝎毒素 |
| 1.3.1 蝎毒素概况 |
| 1.3.2 蝎毒素的分类 |
| 1.3.3 东亚钳蝎神经毒素BmK IT |
| 1.3.4 蝎昆虫神经毒素的研究与应用 |
| 1.4 论文的设计思路 |
| 1.4.1 研究内容与意义 |
| 1.4.2 实验方法 |
| 1.4.3 实验流程图 |
| 第二章 凋亡抑制因子Ac-IAP1/2 的功能分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验设备 |
| 2.2.2 实验所用细胞、病毒、菌株及载体 |
| 2.2.3 主要试剂及其配制 |
| 2.2.4 寡聚核苷酸 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp的构建 |
| 2.3.2 Sf9细胞的培养 |
| 2.3.3 病毒粒子滴度 |
| 2.3.4 蚀斑实验分析重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp的效价 |
| 2.3.5 荧光显微镜观察和Western blot检测Ac-IAP1/2-EGFP在AcMNPV- -iap1/2-egfp感染的Sf9细胞中的表达量 |
| 2.3.6 蚀斑实验检测重组杆状病毒AcMNPV-iap1/2-egfp增殖能力 |
| 2.3.7 MTT实验分析重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp对Sf9细胞增殖的影响 |
| 2.3.8 虫试实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组病毒AcMNPV-iap1-egfp的构建 |
| 2.4.2 重组病毒AcMNPV-iap2-egfp的构建 |
| 2.4.3 AcMNPV-iap1/2-egfp感染的Sf9细胞中Ac-IAP1/2-EGFP的表达量分析 |
| 2.4.4 凋亡抑制因子Ac-IAP1/2 对子代病毒增殖的影响分析 |
| 2.4.5 重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp对Sf9细胞增殖的影响分析 |
| 2.4.6 重组病毒AcMNPV-iap1/2-egfp的抗虫效率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 BIR2结构域对于Ac-IAP2的抗凋亡功能至关重要 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验设备 |
| 3.2.2 实验所用细胞、病毒、菌株及载体 |
| 3.2.3 主要试剂及其配制 |
| 3.2.4 寡聚核苷酸 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Ac-IAP1/2 的序列和结构分析 |
| 3.3.2 重组病毒AcMNPV-iap2~(-BIR2 (iap1))-egfp的构建 |
| 3.3.3 Sf9细胞的培养 |
| 3.3.4 蚀斑实验分析重组病毒AcMNPV-iap2~(-BIR2 (iap1))-egfp的效价 |
| 3.3.5 荧光显微镜观察和Western blot检测Ac-IAP2~(-BIR2 (iap1))-EGFP在AcMNPV-iap2~(-BIR2 (iap1))-egfp感染的Sf9细胞中的表达量 |
| 3.3.6 MTT实验分析重组病毒AcMNPV-iap2-BIR2 (iap1)-egfp对Sf9细胞增殖的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Ac-IAP1/2 的序列与结构 |
| 3.4.2 重组病毒AcMNPV-iap2~(-BIR2 (iap1))-egfp的构建 |
| 3.4.3 AcMNPV-iap2~(-BIR2 (iap1))-egfp感染的Sf9细胞中Ac-IAP2~(-BIR2 (iap1))-EGFP的表达量 |
| 3.4.4 重组病毒AcMNPV-iap2~(-BIR2 (iap1))-egfp对Sf9细胞增殖的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 Ac-IAP1/2 对重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10)促凋亡活性的协同效应分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验设备 |
| 4.2.2 实验所用细胞及病毒 |
| 4.2.3 主要试剂及其配制 |
| 4.2.4 寡聚核苷酸 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 4.3.2 病毒粒子滴度检测 |
| 4.3.3 重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10) 侵染的Sf9细胞中的病毒粒子积累量的检测 |
| 4.3.4 重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10) 侵染的Sf9细胞中BmK IT的转录水平分析 |
| 4.3.5 Real-time PCR检测重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10)对病毒衣壳蛋白VP39转录水平的影响 |
| 4.3.6 DAPI染料检测AcMNPV和AcMNPV-BmK IT (P10)侵染的宿主细胞的核形态 |
| 4.3.7 MTT分析重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10)和AcMNPV-iap1/2-egfp协同共侵染对Sf9细胞增殖的影响 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10) 在宿主细胞内子代病毒粒子积累量的分析 |
| 4.4.2 重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10)侵染宿主细胞过程中BmK IT的转录水平分析 |
| 4.4.3 重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10)侵染过程中衣壳主蛋白VP39的转录水平分析 |
| 4.4.4 病毒AcMNPV和AcMNPV-BmK IT (P10)对宿主细胞核形态的影响 |
| 4.4.5 Ac-IAP1/2 对重组病毒AcMNPV-BmK IT (P10) 促凋亡活性的协同效应分析 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（7）AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的抗虫机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.2 杆状病毒的分类 |
| 1.1.3 杆状病毒生活史 |
| 1.1.4 杆状病毒核心基因 |
| 1.1.5 杆状病毒病毒粒子相关蛋白分类 |
| 1.1.6 杆状病毒启动子的相关研究 |
| 1.2 蝎神经毒素的研究 |
| 1.2.1 蝎神经毒素概述 |
| 1.2.2 蝎神经毒素的分类 |
| 1.3 转录因子P53的研究 |
| 1.3.1 病毒感染与宿主细胞DNA损伤应答 |
| 1.3.2 宿主细胞对抗病毒侵染的机制之一:细胞凋亡 |
| 1.3.3 p53基因概述 |
| 1.3.4 P53与细胞凋亡 |
| 1.4 杆状病毒对宿主细胞肌动蛋白的影响 |
| 1.4.1 肌动蛋白概述 |
| 1.4.2 病毒复制与运输中肌动蛋白作用的研究 |
| 1.5 论文设计思路 |
| 1.5.1 研究内容及意义 |
| 1.5.2 实验方法及流程 |
| 1.5.3 研究创新点 |
| 第二章 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53表达及核内聚集的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 病毒、抗体及细胞 |
| 2.2.2 主要生化试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 2.3.2 蚀斑检测 |
| 2.3.3 Western blot检测AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53表达的影响 |
| 2.3.4 免疫荧光检测AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53在核内聚集的影响 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53表达的影响 |
| 2.4.2 免疫荧光检测AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53在核内聚集的影响 |
| 2.4.3 Western blot分析AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞凋亡蛋白P53在核内聚集的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞肌动蛋白重排的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞和病毒 |
| 3.2.2 主要生化试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 3.3.2 蚀斑检测 |
| 3.3.3 免疫荧光检测AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞肌动蛋白重排的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞肌动蛋白重排的影响 |
| 3.4.2 Western blot分析AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对Sf9细胞肌动蛋白核内聚集的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫侵染机制的分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 病毒和幼虫 |
| 4.2.2 主要生化试剂 |
| 4.2.3 主要与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 对棉铃虫幼虫的感染 |
| 4.3.2 RT-PCR检测AcMNPV早、晚期启动子调控BmK IT在中肠组织的表达 |
| 4.3.3 RT-PCR检测AcMNPV早、晚期启动子调控BmK IT在表皮组织的表达 |
| 4.3.4 TUNEL法检测AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的重组病毒侵染棉铃虫后肠组织细胞凋亡情况 |
| 4.3.5 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫体内酚氧化酶活性的影响 |
| 4.3.6 Western blot分析AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫中肠组织细胞P53表达的影响 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AcMNPV早、晚期启动子调控BmK IT在中肠组织的表达分析 |
| 4.4.2 AcMNPV早、晚期启动子调控BmK IT在表皮组织的表达分析 |
| 4.4.3 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的重组病毒侵染棉铃虫诱导肠组织细胞凋亡的情况 |
| 4.4.4 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫体内酚氧化酶活性的影响 |
| 4.4.5 AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT对棉铃虫中肠组织细胞P53表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（8）基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）抗性素材创新及抗性机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 家蚕的主要病原 |
| 1.2.1 细菌病原 |
| 1.2.2 真菌病原 |
| 1.2.3 病毒病原 |
| 1.3 BmNPV侵染及家蚕防御 |
| 1.3.1 BmNPV侵染过程 |
| 1.3.2 家蚕免疫应答 |
| 1.3.3 内源抗性基因 |
| 1.3.4 外源抗性基因 |
| 1.4 转基因与RNAi |
| 1.4.1 转基因 |
| 1.4.2 RNAi |
| 1.4.3 转基因干涉 |
| 1.5 转基因抗病策略 |
| 1.5.1 增量表达抗性基因 |
| 1.5.2 干涉病原基因 |
| 1.5.3 调控免疫通路 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 增量表达Bmlipase-1在感染初始阶段抑制BmNPV提高家蚕抗性 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器试剂及溶液的配置 |
| 3.1.3 主要实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕抗性检测平台的建立 |
| 3.2.2 增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕分子检测 |
| 3.2.3 增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕抗性检测 |
| 3.2.4 增量表达Bmlipase-1的转基因家蚕主要经济性状调查 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 干涉BmNPV基因在mRNA转录阶段抑制病毒提高转基因家蚕抗性 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 家蚕转基因干涉系统的制备 |
| 4.2.2 转基因干涉系统的插入位点检测 |
| 4.2.3 比较基因片段和间区的连接模式 |
| 4.2.4 比较不同启动子 |
| 4.2.5 比较不同时期靶标基因 |
| 4.2.6 比较必需与非必需基因 |
| 4.2.7 转基因干涉系统的经济性状调查 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 增量表达hycu-ep32在蛋白合成阶段抑制BmNPV提高转基因家蚕抗性 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 增量表达hycu-ep32的转基因家蚕制备 |
| 5.2.2 转基因家蚕的插入位点检测 |
| 5.2.3 转基因家蚕的hycu-ep32表达量检测 |
| 5.2.4 转基因系统的抗性检测 |
| 5.2.5 转基因家蚕感染BmNPV后的hycu-ep32表达量检测 |
| 5.2.6 转基因系统攻毒后的病毒DNA拷贝数检测 |
| 5.2.7 转基因系统的经济性状调查 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 干涉BmPGRP2激活宿主先天免疫反应抑制BmNPV提高转基因家蚕抗性 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要试剂和仪器 |
| 6.1.3 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BmPGRP2的克隆和序列分析 |
| 6.2.2 BmPGRP2的进化分析 |
| 6.2.3 BmPGRP2的亚细胞定位 |
| 6.2.4 BmPGRP2的时空表达谱检测 |
| 6.2.5 BmPGRP2在不同抗性蚕品系中的检测 |
| 6.2.6 干涉BmPGRP2的转基因家蚕制备 |
| 6.2.7 转基因干涉家蚕的BmPGRP2表达量检测 |
| 6.2.8 转基因干涉家蚕的抗病毒能力分析 |
| 6.2.9 转基因干涉家蚕的经济性状调查 |
| 6.2.10 转基因干涉家蚕的免疫通路基因检测 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 不同抗病毒策略的优化和整合 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 主要试剂和仪器 |
| 7.1.3 实验方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 转基因杂交系统的制备和抗性检测 |
| 7.2.2 改进型转基因抗病毒家蚕的制备和检测 |
| 7.2.3 整合四种抗性策略的转基因载体pb-KNT的构建 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 蚕业生产现行实用品种的转基因改良及安全思考 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 实验材料 |
| 8.1.2 主要试剂和仪器 |
| 8.1.3 实验方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 家蚕实用品种非滞育胚胎的制备 |
| 8.2.2 家蚕实用品种的第一次大规模转基因改良 |
| 8.2.3 高抗BmNPV的转基因家蚕的制备 |
| 8.2.4 转基因家蚕的安全思考 |
| 8.2.5 家蚕转基因抗性品系的安全检测中间试验 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 综合与结论 |
| 论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的文章 |
| 申请及授权专利目录 |
| 会议报告 |
| 参研课题 |
| 致谢 |
（9）可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 图表清单 |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 家蚕、杆状病毒与食品 |
| 1.1.1 家蚕与食品的关系 |
| 1.1.2 杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.3 杆状病毒杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.4 重组杆状病毒杀虫剂 |
| 1.2 杆状病毒概况 |
| 1.2.1 杆状病毒分类及生活周期 |
| 1.2.2 杆状病毒与宿主的相互作用 |
| 1.2.3 杆状病毒宿主范围 |
| 1.2.4 杆状病毒的应用 |
| 1.3 家蚕核刑多角体病毒 |
| 1.3.1 家蚕核型多角体病毒简介 |
| 1.3.2 家蚕核型多角体病毒的多样性 |
| 1.3.3 AcMNPV与BmNPV的基因组比较 |
| 1.3.4 BmNPV基因的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 研究的技术路线 |
| 2 Bm65基因生物信息学分析 |
| 2.1 分析软件及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bm65的核苷酸及氨基酸的序列特征 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 Bm65的原核表达、真核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种、载体、实验动物 |
| 3.1.2 酶和化学试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 缓冲液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计及PCR |
| 3.2.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 目的蛋白的割胶纯化 |
| 3.2.5 抗血清的制备 |
| 3.2.6 SDS-PAGE及免疫印迹分析 |
| 3.2.7 pAc~(Bm65-egfp)的构建 |
| 3.2.8 细胞转染 |
| 3.2.9 转染上清感染sf9细胞 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bm65的克隆 |
| 3.3.2 Bm65基因的原核表达及检测 |
| 3.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.4 Bm65蛋白多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.5 Bm65真核表达基因的克隆 |
| 3.3.6 HTB-ie1-egfp-Bm65z-SV40的构建及鉴定 |
| 3.3.7 pAc~(Bm65-egfp) bacmid的构建及鉴定 |
| 3.3.8 pAc~(Bm65-egfp)转染sf9细胞 |
| 3.3.9 免疫印迹检测Bm65的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Bm65在BmN细胞中的转录分析和蛋白定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和试剂 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 5’-RACE分析 |
| 4.2.4 免疫荧光观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Bm65的转录分析 |
| 4.3.2 Bm65的表达时相 |
| 4.3.3 Bm65的亚细胞定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 Bm65缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、菌株、试剂 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 抗生素配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Bm65基因打靶线性化片段的制备 |
| 5.2.2 电转化感受态DH10Bac细胞制备 |
| 5.2.3 电击转化同源重组 |
| 5.2.4 含有pBm~(Bm65KO)的菌株中pBAD-gbaA质粒的去除 |
| 5.2.5 供体质粒pFB1-polh-gfp-Bm65的构建 |
| 5.2.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建 |
| 5.2.7 细胞转染 |
| 5.2.8 转染上清感染BmN细胞 |
| 5.2.9 病毒滴度测定 |
| 5.2.10 qPCR分析Bm65缺失后对病毒DNA复制的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm65基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 5.3.2 重组质粒pUC18-Bm65US-Cm-Bm65DS的酶切鉴定 |
| 5.3.3 Bm65缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm65的构建及鉴定 |
| 5.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 5.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)在BmN细胞上的复制分析 |
| 5.3.7 病毒DNA复制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 Bm91基因生物信息学分析 |
| 6.1 分析软件及方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Bm91的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 Bm91的多克隆抗体制备、转录分析及蛋白定位 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 BV的纯化 |
| 7.2.2 多角体的纯化 |
| 7.2.3 ODV的纯化 |
| 7.2.4 BV/ODV囊膜蛋白的分离纯化 |
| 7.2.5 BV/ODV核衣壳的分离纯化 |
| 7.2.6 N-糖基化抑制实验 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 Bm91的克隆 |
| 7.3.2 Bm91基因的原核表达及检测 |
| 7.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 7.3.4 Bm91蛋白的多克隆抗体制备及抗体的检测 |
| 7.3.5 Bm91的转录分析 |
| 7.3.6 Bm91的表达时相 |
| 7.3.7 Bm91的亚细胞定位 |
| 7.3.8 Bm91蛋白在病毒结构中的定位 |
| 7.3.9 N-糖基化抑制实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 Bm91缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的构建 |
| 8.2.2 重组病毒半数致死剂量(50% lethal dose,LD_(50))的测定 |
| 8.2.3 重组病毒半数致死时间(50% lethal time,LT_(50))的测定 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 Bm91基因打靶线性化片段的PCR扩增 |
| 8.3.2 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的酶切鉴定 |
| 8.3.3 Bm91缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 8.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm91的构建及鉴定 |
| 8.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 8.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)在RmN细胞上的复制 |
| 8.3.7 Bm91缺失病毒的生物学分析 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 总结和展望 |
| 9.1 总结 |
| 9.2 展望 |
| 9.2.1 Bm65的进一步分析 |
| 9.2.2 Bm91的进一步分析 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 发表的研究论文 |
| 导师指导下主持课题 |
| 参与课题 |
（10）斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA复制原点及ORF63基因分析（论文提纲范文）
| 英文缩写符号及中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 斜纹夜蛾及其防治 |
| 1.1.1 农林害虫斜纹夜蛾 |
| 1.1.2 斜纹夜蛾的防治 |
| 1.2 杆状病毒概述 |
| 1.2.1 杆状病毒的分类 |
| 1.2.2 杆状病毒的形态和结构 |
| 1.2.3 杆状病毒的生活周期 |
| 1.3 杆状病毒基因组研究 |
| 1.3.1 杆状病毒基因组结构 |
| 1.3.2 杆状病毒基因组 DNA 的复制机构 |
| 1.3.2.1 杆状病毒复制原点 |
| 1.3.2.2 与病毒 DNA 复制相关保守基因 |
| 1.3.3 基因组的重组 |
| 1.4 杆状病毒的基因研究 |
| 1.4.1 杆状病毒的基因结构 |
| 1.4.1.1 启动子基序 |
| 1.4.1.2 非翻译区 |
| 1.4.1.3 开放阅读框（ORFs） |
| 1.4.2 杆状病毒基因及其功能 |
| 1.5 杆状病毒的应用研究 |
| 1.5.1 杆状病毒可作为载体表达系统 |
| 1.5.2 杆状病毒可作为生物杀虫剂 |
| 1.5.3 杆状病毒可用于基因治疗 |
| 1.5.4 杆状病毒可作为表面展示系统 |
| 1.5.5 杆状病毒表达系统的不足和展望 |
| 1.6 研究目的与研究内容 |
| 1.6.1 研究目的及意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 昆虫、病毒株和细胞系 |
| 2.1.2 质粒载体和受体菌 |
| 2.1.3 酶和主要试剂 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.1.5 PCR 引物 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.1.1 生物软件资源 |
| 2.2.1.2 生物信息学网络资源 |
| 2.2.1.3 序列比对和同源性分析 |
| 2.2.2 基因组 DNA 的提取 |
| 2.2.3 基因片段的 PCR 扩增 |
| 2.2.4 PCR 产物的回收 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备（CaCl2 法） |
| 2.2.7 重组质粒的转化 |
| 2.2.8 重组质粒的筛选（快速细胞破碎法） |
| 2.2.9 碱裂解法少量制备质粒 DNA |
| 2.2.10 酶切鉴定反应 |
| 2.2.11 融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.12 表达产物存在形式的检测 |
| 2.2.13 SDS-PAGE 蛋白电泳 |
| 2.2.14 重组蛋白的大量诱导表达 |
| 2.2.15 包涵体蛋白样品的处理 |
| 2.2.16 融合蛋白的纯化 |
| 2.2.17 Ni 柱的再生 |
| 2.2.18 蛋白浓度的测定（Bradford 法） |
| 2.2.19 融合蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.20 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.21 多克隆抗体效价的测定（ELlSA 法） |
| 2.2.22 各时相总 RNA 的提取和反转录 |
| 2.2.23 Realtime PCR 和标准曲线制作 |
| 2.2.24 昆虫细胞的传代与培养 |
| 2.2.25 细胞的冻存 |
| 2.2.26 细胞的复苏 |
| 2.2.27 脂质体介导的功能质粒在昆虫细胞系中的转染与瞬时表达 |
| 2.2.28 萤光素酶标记的启动子活性分析 |
| 2.2.29 细胞总 DNA 的抽提及定量 |
| 2.2.30 总蛋白质的提取及定量 |
| 2.2.31 Western Blot 检测 |
| 2.2.32 免疫荧光细胞化学 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 同源重复区（hrs）功能分析 |
| 3.1.1 hrs 生物信息学分析 |
| 3.1.2 hrs 功能质粒的构建 |
| 3.1.3 hrs 复制功能分析 |
| 3.1.4 hrs 增强功能分析 |
| 3.1.5 64bp 回文序列功能分析 |
| 3.1.6 hrs 特征结构与复制增强效率的相互关系 |
| 3.2 ORF63 生物信息学分析 |
| 3.2.1 序列分析 |
| 3.2.2 保守结构域分析 |
| 3.2.3 同源性分析 |
| 3.2.4 信号肽分析 |
| 3.2.5 GP63 的跨膜结构域分析 |
| 3.2.6 疏水性分析 |
| 3.2.7 功能结构域分析 |
| 3.2.8 磷酸化、糖基化位点预测 |
| 3.2.9 二级结构分析 |
| 3.2.10 卷曲螺旋分析 |
| 3.3 ORF63 启动子活性与转录时相分析 |
| 3.3.1 启动子特征基序分析 |
| 3.3.2 功能质粒的构建 |
| 3.3.3 启动子活性分析 |
| 3.3.4 ORF63 在细胞中转录时相分析 |
| 3.3.5 ORF63 在宿主中转录时相分析 |
| 3.4 ORF63 原核表达与抗体制备 |
| 3.4.1 ORF63 重组质粒构建 |
| 3.4.2 ORF63 原核表达 |
| 3.4.3 ORF63 融合蛋白的纯化 |
| 3.4.4 ORF63 融合蛋白的质谱鉴定 |
| 3.4.5 ORF63 蛋白质浓度测定 |
| 3.4.6 多克隆抗体制备及效价检测 |
| 3.5 ORF63 表达时相与亚细胞定分析 |
| 3.5.1 ORF63 在宿主中表达时相分析 |
| 3.5.2 ORF63 在细胞中表达时相分析 |
| 3.5.3 ORF63 亚细胞定位分析 |
| 3.5.4 ORF6、ORF57 和 ORF146 等亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 杆状病毒基因组 DNA 复制原点分析 |
| 4.2 ORF63 转录时相分析 |
| 4.3 ORF63 表达时相分析 |
| 4.4 ORF63 亚细胞定位分析 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表的主要论文 |
四、棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)（论文参考文献）
- [1]甜菜夜蛾miR-2763对Se301细胞和甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）感染的影响[D]. 刘志成. 贵州师范大学, 2021
- [2]苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究[D]. 樊江斌. 西北农林科技大学, 2020
- [3]EoNPV基因组分析及对茶尺蠖两近缘种毒力差异研究[D]. 李红. 中国农业科学院, 2020
- [4]家蚕围食膜因子基因Bm011851在幼虫感染BmNPV过程中的功能研究[D]. 郑思敏. 西南大学, 2020(01)
- [5]利用BmNPV Bac-to-Bac系统在家蚕体内表达狂犬病毒M蛋白及抗体制备[D]. 郭望. 广西大学, 2019(01)
- [6]AcMNPV凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能研究[D]. 曹蕾菥. 山西大学, 2017(03)
- [7]AcMNPV早、晚期启动子调控表达BmK IT的抗虫机制研究[D]. 李星. 山西大学, 2016(06)
- [8]基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）抗性素材创新及抗性机制研究[D]. 蒋亮. 西南大学, 2013(10)
- [9]可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析[D]. 唐琦. 江苏大学, 2013(07)
- [10]斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA复制原点及ORF63基因分析[D]. 刘惠芬. 山东农业大学, 2012(03)