大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与表达

论文摘要

抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用,但是随着抗生素的不恰当使用,由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加,大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频率、高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE等主动外排系统,其中AcrAB-TolC外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。AcrAB-To1C包括药物质子转运子AcrB、间质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC。AcrAB的表达水平受多种调控因子的调节,如acrR、marA、mppA、sdiA、rob和soxS等,其中,rob是其中的一个正向调控因子。选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922,分别以其染色体DNA为模板,通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob片段,将上述基因片段分别与克隆载体pMD18-T simple Vector连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明:不同动物源性大肠杆菌的rob基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高,核苷酸序列同源性在98.7%～99.9%,氨基酸同源性在98.6%～100.0%。rob基因突变位点是否影响了rob对AcrAB-Tolc外输泵的调控作用,进而影响其多重耐药水平,还有待进一步研究。将重组质粒pMD18-T-rob和pPICZαA分别用KpnI和XbaI酶切后构建成表达质粒pPICZαA-rob,构建后的重组质粒电转化进GS115酵母感受态细胞中,阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱导起始OD600值等)以及发酵上清浓缩液的SDS-PAGE电泳分析结果表明大肠杆菌多重耐药调控基因rob在毕赤酵母中能够表达,表达的目的蛋白的分子量约为33kDa,与预测的分子量大小相符。本试验获得的临床分离大肠杆菌多重耐药调控基因rob的核苷酸序列同源性比较分析结果,可为深入研究其AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考;获得的rob基因表达蛋白,将为进一步制备其抗体,建立快速有效的该基因表达水平检测方法,阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 综述一 大肠杆菌耐药分子机制
• 1 抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生
• 2 酶对抗生素的修饰和破坏
• 3 细菌细胞膜通透性改变使抗生素不易或无法进入细胞内
• 4 增加抗菌药物从大肠杆菌向细胞外的主动排出
• 综述二 大肠杆菌AcrAB-TolC系统研究进展
• 1 AcrAB-TolC系统的结构及功能
• 2 AcrAB-TolC系统的药物外排机制
• 3 AcrAB-TolC系统的调控机制
• 第二部分 实验部分
• 实验一 大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与序列分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 大肠杆菌多重耐药调控基因rob的毕赤酵母表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介