系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞IL-10和IL-13基因调控序列甲基化状态研究

论文摘要

目的：DNA甲基化异常在系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus, SLE）发病中发挥重要作用,而白介素（Interleukin, IL）IL-10和IL-13在SLE病人自身抗体的产生以及Th2细胞分化中起重要作用。然而,导致SLE患者IL-10和IL-13过度表达的机制并不清楚。本研究主要探讨SLE患者CD4+T细胞中IL-10和IL-13基因调控序列的甲基化状态及其过度表达的机制。方法：密度梯度离心法分离正常人、SLE患者外周血单个核细胞,用免疫磁珠分离外周血细胞CD4+T细胞,加入1μM甲基化抑制剂5-氮杂胞甙（5-azaC）,在RPMI 1640/10% FCS/IL-2中孵育至少72h。实时定量RT-PCR（real-time RT-PCR）检测CD4+T细胞中IL-10和IL-13的mRNA表达水平；酶联免疫吸附实验（ELISAs）检测血清中IL-10和IL-13的蛋白水平；亚硫酸氢钠测序法检测IL-10和IL-13基因调控区域的甲基化状态。结果：与正常对照组相比,SLE患者CD4+T细胞IL-10和IL-13mRNA水平显著升高（IL-10:P=0.001; IL-13:P=0.012）; ELISA结果显示SLE患者血清中IL-10和IL-13的蛋白水平显著增加（IL-10：P=0.005；IL-13：P=0.007）；亚硫酸氢钠测序结果表明SLE CD4+T细胞IL-10和IL-13基因调控区域的DNA甲基化水平显著降低（IL-10：P=0.036；IL-13：P=0.006）,并且分别与IL-10和IL-13的mRNA表达呈显著负相关（IL-10:p=0.04；IL-13:P=0.006）；DNA甲基化抑制剂5-azacytidine （5-azaC）处理正常CD4+T细胞可增加IL-10和IL-13基因mRNA表达（IL-10:p=0.017；IL-13:p=0.025）。结论：DNA甲基化参与调控SLE患者CD4+T细胞中IL-10和IL-13表达；SLE患者IL-10和IL-13调控序列低甲基化在SLE发生发展中发挥重要作用。

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摘要

ABSTRACT

第一章前言

第二章材料与方法

2.1 研究对象

2.2 仪器设备与试剂

2.2.1 主要仪器设备

2.2.2 主要试剂及耗材

2.2.3 其他常用试剂

2.2.4 常用试剂配制

2.2.5 克隆所用试剂配制

2.3 实验步骤

2.3.1 外周血单核细胞分离与5-azaC处理

+T细胞'>2.3.2 磁珠分离CD4⁺T细胞

2.3.3 RNA抽提

2.3.4 实时定量RT-PCR

2.3.5 外周血血清的提取

2.3.6 酶联免疫吸附试验（ELISAs）

2.3.7 DNA抽提

2.3.8 亚硫酸氢钠测序

2.3.9 实验总流程图

2.3.10 统计学分析

第三章结果

+T细胞IL-10和IL-13mRNA的表达水平'>3.1 SLE患者及正常对照组外周血CD4⁺T细胞IL-10和IL-13mRNA的表达水平

3.2 SLE患者及正常对照组外周血血清中IL-10和IL-13的蛋白表达水平

+T细胞IL-10基因调控序列甲基化水平'>3.3 SLE患者及正常对照组外周血CD4⁺T细胞IL-10基因调控序列甲基化水平

+T细胞IL-13基因调控序列甲基化水平'>3.4 SLE患者及正常对照组外周血CD4⁺T细胞IL-13基因调控序列甲基化水平

+T细胞后体外IL-10和IL-13基因mRNA的转录水平'>3.5 5-azaC处理正常CD4⁺T细胞后体外IL-10和IL-13基因mRNA的转录水平

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间主要研究成果

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