雷公藤红素通过HIF-1α-Sema4D信号通路对乏氧诱导血管新生的抑制作用的研究

论文摘要

第一部分雷公藤红素对乏氧诱导的血管新生的影响及其机制研究目的：研究雷公藤红素（Celastrol）对乏氧诱导的肿瘤血管新生的影响,并探讨其可能机制。方法：不同浓度的Celastrol处理乏氧条件下的血管内皮细胞株（EA.hy926）和肿瘤细胞株（HepG2和A549）6h或16h后,采用MTT法检测Celastrol对乏氧条件下细胞增殖的影响；小管形成实验及迁徙实验检测Celastrol对乏氧诱导的内皮细胞血管新生的影响；FITC-phalloidin及侵袭实验检测Celastrol对乏氧诱导的肿瘤细胞侵袭能力的影响；Real-time PCR检测Celastrol对乏氧条件下轴突导向因子4D（Semaphor in 4D,Sema4D）mRNA表达的影响；Western blot及ELISA检测Celastrol对乏氧条件下Sema4D膜型及分泌型蛋白表达的影响。结果：Celastrol抑制乏氧条件下血管内皮细胞（EA.hy926）及肿瘤细胞（A549和HepG2）的增殖,干预6h后,IC50值分别为10.16±0.21,11.60±1.61,14.97±0.73μg/mL,作用时间延长至16h时,IC50值分别为6.54±0.30,4.32±0.45,5.66±0.51μg/mL,其抑制作用呈剂量和时间依赖性；乏氧可以诱导内皮细胞迁徙,乏氧干预16h后,透膜细胞数量增加,给予0.25,0.75,2μg/mLCelastrol干预后,可剂量依赖性降低内皮细胞迁徙；乏氧可以诱导内皮细胞小管形成,乏氧干预16h后,细胞连接形成小管样网状结构,给予0.25,0.75,2μg/mLCelastrol干预后,可剂量依赖性抑制内皮细胞形成管腔的能力；乏氧可以诱导肿瘤细胞骨架重建,乏氧干预16h后,F-actin显著增加,中间张力丝平行排列,细长的丝状伪足和片状伪足明显可见,给予2μg/mL Celastrol干预后,F-actin:细胞形态明显回复,仅见少量的丝状和片层伪足；乏氧可以诱导肿瘤细胞侵袭,乏氧干预16h后,穿越Matrigel’‘屏障”的细胞数量增加,给予0.25,0.75,2μg/mL Celastrol干预后,可剂量依赖性抑制肿瘤细胞侵袭；与单纯乏氧组相比,Celastrol处理组明显抑制A549细胞中Sema4D mRNA及膜型和分泌型蛋白的表达。结论：Celastrol能明显抑制乏氧诱导的血管新生,下调Sema4D基因及蛋白的表达可能是Celastrol抗乏氧诱导的血管新生的重要机理之一。第二部分雷公藤红素对乏氧细胞中HIF-1α信号通路的影响目的：研究雷公藤红素（Celastrol）对乏氧诱导的HIF-1α信号通路及其上游信号通路PI3K/Akt的影响。方法：在乏氧条件下培养肝癌细胞株HepG2细胞16h,并以不同浓度Celastrol处理,采用免疫荧光及Western blot检测Celastrol对乏氧诱导的细胞核内HIF-1α表达的影响；Real-time PCR检测Celastrol对常氧及乏氧条件下HIF-1αmRNA表达的影响；Real-time PCR检测Celastrol对HIF-1α革巴基因VEGF及CA9 mRNA表达的影响；ELISA检测Celastrol对VEGF蛋白表达的影响；Western blot检测Celastrol对Akt及pAkt蛋白表达的影响。结果：常氧状态下HepG2细胞中HIF-1α少量表达且主要表达于胞质,单纯乏氧组经16h乏氧干预后HIF-1α表达明显上调且集中表达于胞核,给予2μg/mL Celastrol干预后,HepG2细胞中HIF-1α荧光染色强度明显减弱且胞核中表达下降。Western blot结果显示,常氧下,HepG2细胞中仅有微量核蛋白表达。乏氧16 h, HepG2细胞中HIF-1α核蛋白表达显著增加。给予2μg/mL或4μg/mLCelastrol干预,HepG2细胞中HIF-1α核蛋白表达显著降低。Real-time PCR结果显示,常氧下,0.75-4μg/mL浓度范围内的Celastrol对HIF-1αmRNA的表达有明显的抑制作用。乏氧下,0.25-4μg/mL浓度范围内的Celastrol对HIF-1αmRNA的表达有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。单纯乏氧组与常氧相比,VEGF和CA9mRNA表达量显著增加,0.25-4μg/mL浓度范围内的Celastrol可明显抑制乏氧诱导的VEGF和CA9 mRNA,且该作用呈剂量依赖性。ELISA结果显示,乏氧干预16h后,VEGF的浓度显著增加,给予浓度梯度为0.25,0.75,2μg/mL Celastrol处理后,VEGF浓度明显下降,且呈剂量依赖性。Western blot结果显示,乏氧下,HepG2细胞中Akt和pAkt蛋白均有较强表达,给予0.25-4μg/mL Celastrol干预,HepG2细胞中Akt和pAkt蛋白表达均显著降低。结论：Celastrol能明显抑制乏氧肿瘤细胞中HIF-1α信号通路,该作用部分是通过对PI3K/Akt通路的抑制实现的。下调HIF-1α基因及蛋白的表达可能是Celastrol抗血管新生及抑制Sema4D表达的重要机理之一。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 雷公藤红素对乏氧诱导的血管新生的影响及其机制研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 雷公藤红素对乏氧细胞中HIF-1α信号通路的影响
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 参考文献
• 附录 攻读博士期间发表的论文目录
• 致谢