小鼠精原干细胞分离、纯化、冷冻、培养、移植及其体内介导转基因的研究

论文摘要

精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）指既能自我更新维持自身群体数量恒定,又能定向分化成生殖细胞进而产生精子的一类原始精原细胞,具有干细胞最根本的生物学性质。目前,SSCs的研究在动物精子发生发育机理、医学临床的男性生殖生理和转基因动物的制备等方面具有广阔的应用前景,已成为干细胞研究的热点之一。本试验以小鼠精原干细胞为材料,对其冷冻保存、培养以及体内介导的转基因技术进行初步研究,以期为SSCs的进一步研究和利用提供参考资料。本试验的具体内容如下:1.用组合酶消化法制备6日龄小鼠的生殖细胞悬液;采用差速贴壁法结合Percoll不连续密度梯度离心法分离纯化精原干细胞,接种于含10%胎牛血清的极限必需培养基α（minimum essential medium alpha,MEMα）中,37℃,5%CO2饱和湿度培养,观察培养细胞的生长和形态变化。结果6日龄小鼠的生精小管主要包含细胞为精原干细胞、支持细胞,精原干细胞纯化后纯度达80%以上,精原干细胞主要分布在28%～36%的Percoll梯度中。2.以6日龄雄性昆明小白鼠精原干细胞为材料,加入不同的冷冻液以及采用不同的降温速率冷冻小鼠精原干细胞。以MEMα为基本培养基,加入10%胎牛血清和100ng/mL的胶质细胞源性神经营养因子,体外培养复苏后精原干细胞,WST-8比色法分析培养精原干细胞的增殖率,运用碱性磷酸酶细胞化学染色和逆转录.聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）技术,对培养的精原干细胞进行鉴定,采用睾丸网注射法将非程控降温方式冷冻的小鼠精原干细胞移植到受体不育小鼠睾丸生精小管,检测精原干细胞特性。结果显示,冷冻液中添加10%二甲基亚砜、10%胎牛血清、0.07mol/L蔗糖时,以1℃/min程控降温方式冷冻小鼠SSCs,细胞解冻后活率最高,达84%以上;采用非程控降温方式冻存精原干细胞,尽管细胞解冻后活率相对于程控降温方式略低,但具有方法简单、易于操作、无需昂贵仪器的优点,复苏后精原干细胞贴壁时间为8 h～12 h,24 h可见细胞分裂,48 h细胞出现迅速增殖,96 h可见较多含20～25细胞的细胞团,此时,精原干细胞增殖近5倍;精原干细胞移植后,在受体小鼠睾丸生精小管重新启动精子发生。试验结果表明,本试验所用的冷冻条件可以使经长期冷冻的精原干细胞保留其特性;所用培养条件可以使经长期冷冻的精原干细胞短期快速增殖。3.应用显微注射仪将脂质体包裹的质粒pEGFP-N1通过睾丸网注射到4周龄昆明小白鼠睾丸生精小管内。注射后6周,与自然发情雌鼠交配,分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PcR法和斑点杂交法检测仔鼠基因组中的外源DNA整合。结果,共注射4只雄性小鼠,3只存活,并且具有交配能力,共获仔鼠63只,其中2只为PCR阳性和点杂交阳性仔鼠。试验结果初步证明,用睾丸网注射法制备转基因动物是可行的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 文献综述部分
• 第一章 精原干细胞基本特性和研究进展
• 1 精原干细胞基本特性
• 1.1 精原干细胞的来源
• 1.2 精原干细胞的自我增殖和分化
• 1.3 精原干细胞的生物学特性
• 2 精原干细胞研究进展
• 2.1 精原干细胞分离和纯化
• 2.2 精原干细胞培养
• 2.3 精原干细胞鉴定
• 2.4 精原干细胞基因修饰
• 2.5 精原干细胞冷冻保存
• 2.6 精原干细胞移植
• 2.7 精原干细胞介导转基因技术
• 2.8 精原干细胞应用前景
• 试验研究部分
• 第二章 小鼠精原干细胞的分离和纯化
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要试剂配方
• 2 方法
• 2.1 小鼠睾丸生殖细胞悬液的制备
• 2.2 小鼠精原干细胞纯化
• 2.2.1 细胞差速贴壁法
• 2.2.2 Percoll不连续密度梯度离心法
• 2.2.3 细胞的洗涤及计数
• 2.2.4 细胞接种培养
• 2.2.5 细胞的纯度评估
• 2.3 精原干细胞鉴定
• 2.4 数据统计
• 3 结果
• 3.1 精原干细胞特性
• 3.2 生精细胞在Percoll梯度中的分布
• 3.3 精原干细胞的分离纯度
• 4 讨论
• 4.1 小鼠日龄对精原干细胞分离的影响
• 4.2 消化方法对精原干细胞分离的影响
• 4.3 Percoll不连续密度梯度的纯化效果
• 4.4 精原干细胞的细胞化学特性
• 第三章 小鼠精原干细胞冷冻、培养和移植
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂配方
• 2 方法
• 2.1 小鼠精原干细胞分离
• 2.2 小鼠精原干细胞纯化
• 2.3 小鼠精原干细胞冷冻和解冻
• 2.4 小鼠精原干细胞活率检测
• 2.5 小鼠精原干细胞增殖检测
• 2.6 小鼠精原干细胞鉴定
• 2.7 白消安诱导小鼠无精子症模型
• 2.8 小鼠精原干细胞移植
• 2.9 数据统计
• 3 结果
• 3.1 降温速率对细胞复苏率影响
• 3.2 冷冻保护剂的作用
• 3.3 精原干细胞增殖活性
• 3.4 精原干细胞鉴定
• 3.5 白消安消除内源性生精细胞
• 3.6 精原干细胞移植结果
• 4 讨论
• 4.1 降温速率对精原干细胞冷冻保存的影响
• 4.2 冷冻保护剂对精原干细胞冷冻保存的影响
• 4.3 生长因子对精原干细胞增殖的作用
• 4.4 精原干细胞分子生物学特征
• 4.5 精原干细胞移植
• 第四章 睾丸网注射法生产转基因小鼠
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 pEGFP-N1质粒制备
• 2.2 转染液制备
• 2.3 睾丸网注射法
• 2.4 仔鼠尾尖组织DNA提取
• 2.5 DNA纯度的检测
• 2.6 转基因仔鼠PCR检测
• 2.7 转基因点杂交检测
• 3 结果
• 3.1 质粒制备
• 3.2 转染液在生精小管中的流动规律及分布
• 3.3 雄鼠的交配和受精能力
• 3.4 转基因鼠PCR鉴定
• 3.5 转基因鼠的点杂交分析
• 4 讨论
• 4.1 小鼠睾丸网注射的有效方法
• 4.2 生产转基因动物效率较低原因
• 4.3 应用前景
• 参考文献
• 全文结论
• 图版
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢