耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆

论文摘要

硝基苯废水成分复杂,常含有大量对微生物有抑制作用的盐。基于此,本论文驯化、筛选耐盐硝基苯降解菌,对其进行生理生化鉴定,研究其耐盐和降解硝基苯特性。在此基础上,对其降解硝基苯代谢基因进行定位,并进一步利用现代分子生物学技术克隆到部分基因并对其进行了生物信息学分析。从活性污泥中驯化分离到2株耐盐硝基苯降解菌,通过形态观察、生理生化分析、G+C含量分析和16S rDNA分析分别鉴定为Streptomyces sp.DUTAHX和Micrococcussp.DUTAHX,其16S rDNA序列的GenBank登录序列号分别为DQ409080和DQ409081。Streptomyces sp.DUTAHX的最适生长与降解条件为:温度30℃,pH 7.0,转速150r/min,菌株在唯一碳源培养基中可耐受的最大硝基苯浓度为900 mg/L。Micrococcus sp.DUTAHX的最适生长与降解条件为:温度37℃,pH 7.0,转速150 r/min,菌株在唯一碳源培养基中可耐受的最大硝基苯浓度为600 mg/L。2株菌在以硝基苯为唯一碳、氮和能源的无机盐培养基中生长和降解硝基苯过程中均释放出NH4+,但未检测到NO2-。在80 h内2株菌株对硝基苯的降解率分别为98.8%和97.6%,TOC去除率为99.2%和98.1%,表明硝基苯最终被矿化为二氧化碳和水。2株菌的粗酶主要以2-氨基酚1,6-双加氧酶活性为主。这2株菌降解硝基苯的途径可能都是好氧部分还原途径。Streptomyces sp.DUTAHX是一株中度耐盐细菌。在盐胁迫下某些相容性溶质如甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甜菜碱、四氢嘧啶都能更好的促进其生长,其中甘氨酸的效果最明显,四氢嘧啶的效果最差。利用SDS-PAGE和非变性梯度PAGE电泳分析了盐胁迫或硝基苯诱导下Streptomyces sp.DUTAHX蛋白质的合成变化,其中一些蛋白质的合成被抑制;一些蛋白质的合成被增强:一些起主要调节作用的盐或硝基苯诱导蛋白被重新合成。将非变性梯度PAGE凝胶上的大小为141 kDa的硝基苯诱导蛋白条带切胶电洗脱回收,其具有2-氨基酚1,6-双加氧酶活性,其活性大小为5.825μmol/min/mg protein,该蛋白是Streptomyces sp.DUTAHX降解硝基苯代谢途径中的2-氨基酚1,6-双加氧酶。从Streptomyces sp.DUTAHX提取到一大小约为17 kb的质粒pSNB1。采用提高生长温度和SDS法相结合消除质粒,筛选到一质粒消除菌株AHX-4,失去了氨苄青霉素抗性和降解硝基苯的能力。将质粒pSNB1经CaCl2热激转化法进入大肠杆菌JM109感受态细胞,筛选到一个可在以硝基苯为唯一碳源的无机盐平板上生长的转化大肠杆菌阳性子AHX-JM109,其降解硝基苯的能力大大降低。质粒pSNB1与Streptomyces sp.DUTAHX的抗性基因和降解硝基苯的基因有关,而与耐盐基因无关。以质粒pSNB1为模板和RedF、RedR为引物的简并降落PCR扩增到一大小为465 bp的基因片段,氨基酸序列检索表明,其与Marine actinobacterium PHSC20C1的YHS域蛋白的同源性较高;设计特异性引物进行盒式连接介导PCR,拼接得到大小为2026 bp的序列,开放阅读框分析发现一个编码126个氨基酸的ORF,属于YHS域蛋白,其代表的基因可能是Streptomyces sp.DUTAHX的硝基苯硝基还原酶基因PPHAHX,其GenBank中登录的序列号为EF998874。生物信息学分析表明,pPHAHX基因编码的蛋白理论等电点为4.8,理论分子量为13.49089 kDa,为一位于细胞质的弱酸性、水溶性球状蛋白。通过不同程序预测其二级结构和三级结构,并构建了该蛋白部分三维结构模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 硝基苯废水处理和硝基苯生物降解研究进展
• 1.1 硝基苯废水处理研究进展
• 1.1.1 硝基苯的物理化学性质
• 1.1.2 硝基苯废水的来源和危害
• 1.1.3 硝基苯废水处理技术
• 1.1.4 盐对生物处理方法的影响
• 1.1.5 耐盐微生物的应用
• 1.2 硝基苯生物降解研究进展
• 1.2.1 硝基苯厌氧微生物降解研究
• 1.2.2 硝基苯好氧微生物降解研究
• 1.2.3 硝基苯微生物降解研究总结
• 1.3 本论文的研究内容及意义
• 2 耐盐硝基苯降解菌的分离与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 耐盐硝基苯降解菌的驯化和分离
• 2.1.3 耐盐硝基苯降解菌的形态观察和生理生化分析
• 2.1.4 耐盐硝基苯降解菌的抗性谱
• 2.1.5 耐盐硝基苯降解菌DNA的Cr+C含量分析
• 2.1.6 耐盐硝基苯降解菌的16S rDNA序列分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 耐盐硝基苯降解菌的分离和形态特征
• 2.2.2 耐盐硝基苯降解菌的生理生化分析
• 2.2.3 耐盐硝基苯降解菌的G+C含量和16S rDNA分析
• 2.3 本章小结
• 3 耐盐硝基苯降解菌的特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 分析方法
• 3.1.3 耐盐硝基苯降解菌的生长和降解硝基苯
• 3.1.4 耐盐硝基苯降解菌的粗酶的制备
• 3.1.5 耐盐硝基苯降解菌的粗酶活性的分析
• 3.1.6 硝基苯在耐盐硝基苯降解菌的细胞内外的分布
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 耐盐硝基苯降解菌的生长与降解硝基苯
• 3.2.2 耐盐硝基苯降解菌底物广谱性分析
• 3.2.3 耐盐硝基苯降解菌降解硝基苯过程中氨基和亚硝基的检测
• 3.2.4 耐盐硝基苯降解菌的粗酶活性分析
• 3.2.5 硝基苯在耐盐硝基苯降解菌的细胞内外的分布
• 3.3 本章小结
• 4 耐盐硝基苯降解菌的盐胁迫或硝基苯诱导下的反应
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 盐胁迫对耐盐硝基苯降解菌的生长和降解硝基苯的影响
• 4.1.3 盐胁迫下耐盐硝基苯降解菌的蛋白质的适应性
• 4.1.4 硝基苯诱导下耐盐硝基苯降解菌的蛋白质的适应性
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 盐胁迫对耐盐硝基苯降解菌的生长和降解硝基苯的影响
• 4.2.2 盐胁迫下耐盐硝基苯降解菌的蛋白质的适应性
• 4.2.3 硝基苯诱导下耐盐硝基苯降解菌的蛋白质的适应性
• 4.2.4 盐胁迫或硝基苯诱导下耐盐硝基苯降解菌的蛋白质的适应性的共性
• 4.3 本章小结
• 5 耐盐硝基苯降解菌的硝基苯降解基因的定位
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 耐盐硝基苯降解菌的质粒的提取
• 5.1.3 耐盐硝基苯降解菌的质粒的消除
• 5.1.4 耐盐硝基苯降解菌的质粒的转化
• 5.1.5 质粒消除的耐盐硝基苯降解菌的特性分析
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 耐盐硝基苯降解菌的质粒的提取和消除
• 5.2.2 耐盐硝基苯降解菌的质粒的转化
• 5.2.3 质粒消除的耐盐硝基苯降解菌的特性分析
• 5.3 本章小结
• 6 耐盐硝基苯降解菌的部分基因的克隆与生物信息学分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 耐盐硝基苯降解菌的部分基因的简并PCR
• 6.1.3 耐盐硝基苯降解菌的部分基因的盒式连接介导PCR
• 6.1.4 耐盐硝基苯降解菌的部分基因的生物信息学分析
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 耐盐硝基苯降解菌的部分基因的克隆
• 6.2.2 耐盐硝基苯降解菌的部分基因的生物信息学分析
• 6.3 本章小结
• 7 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 主要创新点
• 7.3 有待深入研究的内容
• 参考文献
• AHX的16S rDNA序列'>附录A GenBank登录Streptomyces sp.DUT_AHX的16S rDNA序列
• AHX的16S rDNA序列'>附录B GenBank登录Micrococcus sp.DUT_AHX的16S rDNA序列
• 附录C pMD19-T载体的结构
• AHX的硝基苯硝基还原酶基因序列'>附录D GenBank登录Streptomyces sp.DUT_AHX的硝基苯硝基还原酶基因序列
• AHX基因编码的蛋白质的三级结构'>附录E Phyre预测pPH_AHX基因编码的蛋白质的三级结构
• 创新点摘要
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
• 个人简历