甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因克隆及结构分析与功能鉴定

论文摘要

甜杨（Populus suaveolens）属杨柳科（Salicacae）杨属（Populus L.）青杨派（Section Tacamahaca）树种,分布于北美、亚洲。在中国,甜杨主要分布于大兴安岭北部及漠河一带,分布区的年平均气温为-3.8 oC,冬季气温为-40.5～-27.4 oC,极端最低气温为-46.9 oC,是研究木本植物抗冻性及有关抗冻基因克隆的理想材料。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH）是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。前期研究表明,低温下G6PDH活性的提高与甜杨抗冻性密切相关。本研究以耐极低温的高大乔木甜杨为试材,建立了其无菌离体培养体系,采用不同方法制备总RNA,并通过RT-PCR和E-PCR相结合的方法进行甜杨G6PDH基因（PsG6PDH）的分离克隆。在此基础上,利用生物信息学手段对获得PsG6PDH基因进行结构分析及功能预测,并开展了PsG6PDH的原核表达及其表达条件优化的研究,以验证目的基因编码框的完整性。最后,构建了PsG6PDH的植物表达载体并导入烟草,通过低温抗性实验以及电导率、SOD活性、POD活性和MDA含量等理化指标的测定,从中探讨PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用。通过上述研究可得到以下结果:1.以茎段为外植体,首次建立了甜杨的离体培养体系。甜杨最佳启动培养基为改良MS附加BA 0.5mg/l、NAA 0.1mg/l,获得无菌苗后,继代培养基为改良MS附加6-BA 0.5mg/l、NAA 0.1mg/l和GA 0.1mg/l,生根培养基为1/4改良MS附加NAA 0.1mg/l和GA 0.1mg/l,叶片分化培养基为改良MS附加BA 2.0mg/l和NAA 0.1mg/l。2.首次克隆了甜杨G6PDH的基因,这也是第一个从杨树中分离到的G6PDH基因。利用E-PCR和RT-PCR成功地从甜杨中分离了G6PDH的全长基因（PsG6PDH）,其长度为1697 bp,可编码510个氨基酸,而且核酸序列及其推导的氨基酸序列均与植物G6PDH具有较高的同源性。同时,运用PCR扩增技术获得了甜杨G6PDH基因组序列,测序结果表明,基因组DNA长度为5040 bp,含有14个外显子和13个内含子。Southern杂交结果表明,G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。3.采用Antherwin 5.0软件分析了PsG6PDH的理化特性,并运用Clustal X1.83软件构建了PsG6PDH的系统进化树,结果表明,甜杨PsG6PDH为易溶、亲水性强的蛋

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文缩略词（ABBREVIATION）
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物抗寒冻分子机制研究概况
• 1.2 基因工程在植物抗寒冻性改良中的应用现状
• 1.3 杨树抗寒冻研究进展
• 1.4 立题依据与技术路线
• 2 甜杨G6PDH 基因的分离与克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 甜杨PSG6PDH 的生物信息学分析
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果和分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 甜杨PSG6PDH 基因的原核表达
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 甜杨PSG6PDH 转化烟草研究
• 5.1 材料和方法
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 结论及研究展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 研究生期间发表的论文
• 致谢
• 博硕士学位论文同意发表声明