hIL-10基因修饰树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

论文摘要

目的建立体外培养、诱导和扩增DA（Dark Agouti）大鼠骨髓来源的树突状细胞的方法;建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反应模型,用hIL-10基因修饰大鼠骨髓来源的不成熟树突状细胞（imDC）;探讨其诱导同种异体大鼠原位肝移植免疫耐受的情况。方法1.培养、诱导和扩增DA大鼠骨髓来源的DC,经形态学、免疫表型及功能鉴定后,将pIRES2-EGFP- hIL-10质粒转染imDC,检测hIL-10在imDC中的表达。2.建立改良的大鼠原位肝移植模型和DA大鼠→Lewis大鼠急性排斥反应模型:在原二袖套法的基础上,采用快速切取供肝,一针法连续缝合肝上下腔静脉以及对出血点进行热止血等方法,进行120例大鼠原位肝移植,并观察术后存活率。3.行以DA大鼠为供体、近交系Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植100例,随机均分为5组:未注射DC组（对照组）、mDC组、imDC组、空载体组、及hIL-10转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC和hIL-10修饰的imDC各2×106个,于肝移植术后3d、7d、10d各处死4只,观察外周血肝功能变化（ALT和TBIL）,肝脏病理改变,外周血清细胞因子情况,各组除去技术死亡的受鼠,将余下受鼠作生存分析,死亡时取肝脏行病理组织学检查。结果1.成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源DC的方法;经倒置相差显微镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为DC。形态学结果显示:DC形态不规则,细胞核大而偏位,细胞表面可见细长树枝状突起。免疫表型结果显示:mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而共刺激分子CD86在mDC呈高表达,在imDC呈低表达。混合淋巴细胞反应（MLR）结果显示:imDC刺激同种异体T淋巴细胞的能力明显弱于mDC（P=0.005）。pIRES2-EGFP- hIL-10质粒经基因测序显示其序列与Pubmed基因库的hIL-10序列相符合;经PCR鉴定示在540bp处有明显的条带。荧光显微镜观察显示pIRES2-EGFP- hIL-10质粒转染imDC后可见黄绿色荧光。流式细胞术显示转染后DC表面分子CD86和CD80的表达未受影响。转染后MLR显示,hIL-10转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组和空载体组（P=0.024和P=0.033）。ELISA检测IL-10组的hIL-10表达明显高于mDC组、imDC组及空载体组（P=0.004、0.004及0.003）;经Westen-Blot检测有hIL-10蛋白表达。2.成功建立改良的大鼠原位肝移植模型和急性排斥反应模型。3.活体观察:移植后的肝脏病理组织学切片显示IL-10组术后仅有较少量的单核细胞浸润,RAI评分2～5分,属非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应,10d开始出现肝细胞再生,有少量的中性粒细胞浸润。肝功能示IL-10组在7d、10d时,肝功能有所恢复,但与imDC组及空载体组相比差异无统计学意义。ELISA检测示,术后7d,IL-10组的血清IL-12浓度均低于对照组、mDC组、imDC组及空载体组（P为0.000、0.000、0.005及0.008）。IL-10组中位生存期40d均长于imDC组（23d）和空载体组（25d）（P均为0.002）。结论1.本实验通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合,能培养、诱导、扩增大量的DC;hIL-10基因转染imDC能够获得有效的表达,转染后对imDC表型没有明显影响;hIL-10基因转染可明显降低imDC对同种异体T淋巴细胞的反应性。2.经改良的大鼠原位肝移植方法,手术时间短,成功率高,稳定可靠,建立了比较稳定的大鼠原位肝脏移植模型,可满足本实验的要求。3.hIL-10基因修饰的imDC能诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受,显著延长同种异体肝移植大鼠的生存期。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 大鼠骨髓来源的树突状细胞的体外培养与鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 hIL-10 基因在大鼠im DC 中的表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 hIL-10 基因修饰im DC 诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 综述