桑黄、蛴螬药用活性成份的分离纯化与功能研究

论文摘要

“桑黄”为担子菌亚门（Basidiomycotina）,层菌纲（Hymenomycetes）,多孔菌目（Polyporales）,锈革孔菌科（Hymenochaetacae）,针层孔菌属（Phellinus）的真菌,,东亚的国家中已经被当作一种传统的药使用,用于治疗胃肠混乱,降火和淋巴的疾病。特别是它的抗肿瘤活性,桑黄也有许多优势作为抗癌候选药之一,被人们所关注。本文的第一部分研究内容为从桑黄发酵液中分离活性成份,寻找具凝集活性、抗菌活性的有机分子,为开发新的天然药物作准备。本实验通过冷冻干燥、离子交换和HPLC层析等方法,从药用真菌桑黄的发酵液中分离纯化了一种凝集素,SDS-PAGE检测其为单一蛋白条带,分子量约24kDa,与HPLC分析分子量一致,证明该凝集素为单亚基蛋白。SHL可以凝集供试的小鼠血红细胞和4种血型人血的血红细胞,但对不同来源的血红细胞凝集滴度不同。糖抑制实验表明,SHL不被D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖所抑制。SHL具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca2+、Mg2+和Zn2+等二价阳离子的影响。用相似的处理方法,我们从桑黄发酵液中分离到一种相对分子质量为20kD的抗真菌生物活性物质。桑黄已经被知道具有各种不同的生物学的活性.但是从鲍氏针层孔菌（Phellinus baumii）提取多糖却极少被报道.本实验中水溶性多糖由热水抽出与菌丝分开,游离蛋白质用Sevage法移除。多糖由阴离子交换和凝胶层析纯化。由DEAE-Sephadex-50阴离子交换层析时用0-1.1M NaCl洗脱.再用纯化后,再用sephadex G-75测定其分子量为17,000D.再测定其各项生物活性,该多糖被发现显着地增加巨噬细胞的增殖.同时,可以明显抑制HepG2细胞和HCT细胞的增殖.本文的第二部分研究内容为白星花金龟幼虫中多糖的提取与纯化。用相似的处理方法,以我国药用昆虫白星花金龟（Protaetia brevitarsis）幼虫（蛴螬）为研究对象,通过匀浆,乙醇沉淀,Sevag法去除蛋白,得到蛴螬总多糖。经MTT法检测,证明其对小鼠脾细胞及巨噬细胞有明显的促增殖作用。对总多糖用苯酚硫酸法进行浓度测定,并用离子柱DEAE-Sephadex A-25,LPLC-Sephadex G-75分离纯化得到两种可以促进脾细胞增殖的,分子量分别为42kDa和26kDa的蛴螬多糖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.桑黄及其药理作用研究进展
• 1.1.药用真菌"桑黄"的分类及生物学特征
• 1.2.药用真菌的生长特性
• 1.3 桑黄的药理作用
• 1.4 前景与展望
• 2.多糖类药物的研究进展
• 2.1 多糖背景
• 2.2 多糖的提取分离、分离、纯化
• 2.3 多糖的药理作用
• 2.4 多糖的发展前景
• 3.凝集素的研究历史及进展
• 3.1 凝集素的糖与血型特异性
• 3.2 凝集素对淋巴细胞的促有丝分裂作用和对癌细胞凝集
• 3.3 大量凝集素的发现
• 3.4 从凝集素的一级结构到三级结构
• 3.5 凝集素的糖识别域
• 3.6 凝集素的保护和共生作用
• 3.7 凝集素作为识别分子
• 4.蛴螬及其药理作用研究进展
• 参考文献
• 第二章 桑黄发酵液凝集素的分离纯化和功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 发酵时间对凝集活性的影响
• 2.2 凝集素的纯化和检测
• 2.3 采用SDS-PAGE垂直板型凝胶电泳测定分子量
• 2.4 糖抑制实验
• 2.5 金属离子及EDTA对凝血活性的影响
• 2.6 pH对血凝活力的影响
• 2.7 温度对血凝活力的影响
• 2.8 Sephadex G-75凝胶层析测定分子量
• 2.9 对各种血细胞的凝集效果
• 3 讨论:
• 参考文献
• 第三章 桑黄发酵液抗真菌活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 抗菌活性检测
• 2.2 抗菌活性成分分离纯化
• 2.3 用Sephadex G-75测定分子量
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 桑黄多糖的分离纯化与功能研究
• 1.材料和方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 MTT法测粗多糖对脾细胞增殖的实验结果
• 2.2 MTT法测粗多糖对巨噬细胞增殖的实验结果,
• 2.3 MTT法测粗多糖对抑制肿瘤细胞增殖的实验结果,
• 2.4 多糖的分离纯化
• 2.5 以葡萄糖作标准曲线实验结果
• 2.6 用Sephadex G-75测定分子量
• 3.讨论
• 参考文献
• 第五章 蛴螬多糖对小鼠免疫细胞体外增殖的研究
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 以葡萄糖作标准曲线测定浓度
• 2.2 粗多糖对脾细胞增殖作用
• 2.3 MTT法测粗多糖对巨噬细胞增殖作用
• 2.4 多糖的分离纯化
• 2.5 用Sephadex G-75测定分子量
• 3.讨论
• 参考文献
• 创新之处
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录