胎儿核酸检测分析方法的研究

论文摘要

产前诊断一直人类遗传学领域的研究重点,目前临床上常用的诊断方法主要有羊水穿刺和绒毛膜诊断等,这些方法对产妇和胎儿均有较大的危害,而且操作相对繁琐。近年来胎儿DNA的发现为这一问题的解决提供了可能,使得无创性产前诊断不再是梦想。随后的研究证实胎儿RNA也存在于孕妇的外周血液中,这为该研究的进一步发展提供了新的途径。尽管无创性产前诊断在近年来取得了较大的进展,但仍然与临床实际应用存在着很大的差距,特别是在胎儿核酸的高灵敏度和高通量检测方面。为此,我们以不同怀孕时期的孕妇外周血液为研究对象,结合基因芯片技术,发展了胎儿DNA和RNA的高通量检测技术并且应用于胎儿相关基因的检测分析中。本论文的主要研究内容有:胎儿核酸分离纯化方法的研究;胎儿DNA的扩增检测方法的研究;胎儿RNA定量检测分析方法的研究;孕妇血浆DNA甲基化的初步研究。具体内容如下:1.孕妇血浆核酸提取方法的研究我们以现有的核酸提取分离方法为基础,结合孕妇外周血液中胎儿核酸的特性,发展了改良的胎儿核酸提取纯化方法。我们首先利用甲醛溶液来处理孕妇的外周血液,在新鲜的孕妇血液中加入1%的甲醛溶液,处理30分钟后,离心分离孕妇血浆,然后用常规的树脂吸附法提取血浆DNA,以Y染色体特异性序列作为男性胎儿DNA的标志物,定量检测胎儿DNA的浓度。结果发现采用甲醛处理的实验组提取获得的胎儿DNA占血浆总DNA的比例有了较大的提高。我们还改良了RNA的提取方法,结果发现利用改良的“Trizol”提取法获得的胎儿RNA浓度比普通方法有了较大的提高。这些胎儿核酸的分离纯化方法为无创性产前诊断方法的发展打下了基础。2.微乳液多重PCR技术聚合酶链式反应(PCR)主要用于DNA片断的扩增分析,是生物医学领域一项重要的核酸分析技术。尽管如此,PCR在检测灵敏度、特异性方面仍存在一些问题,多重PCR扩增也因引物等成分之间的干扰而受到了较大的限制。微乳液(油包水)是一种水相均匀的分散到油相中形成的稳定均一的分散系,近年来有人利用微乳液的特殊的结构进行生物化学反应获得了一定的成功。我们通过优化微乳液制备方法和PCR反应体系,成功地在微乳液中进行了PCR扩增。实验结果表明,微乳液体系中的微小液滴结构不但能够提高PCR扩增的效率,而且能够有效的降低多重PCR体系中各个成分特别是引物之间的干扰,从而使多重PCR能够更加有效的进行。我们利用该技术进行了Y染色体微缺失的检测,在不育的男性样品和怀有男性胎儿的孕妇外周血液中我们均检测到了微缺失位点的存在。结果显示微乳液多重PCR技术不但具有很高的灵敏度和特异性,而且能够用于相关疾病的分析检测,可以检测孕妇外周血液中胎儿DNA用于无创性产前诊断,大大推动了产前诊断技术的进一步发展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（Abstract）
• 第一章 绪论
• 1.1 产前诊断的研究现状
• 1.1.1 染色体和细胞水平的检查
• 1.1.2 分子水平的检测
• 1.1.3 影像学检测
• 1.1.4 无创伤性产前诊断的需求
• 1.2 孕妇外周血液中胎儿细胞的研究进展
• 1.2.1 孕妇外周血胎儿细胞的类型
• 1.2.2 胎儿细胞的富集、鉴别及分析技术
• 1.2.3 胎儿有核红细胞的临床应用
• 1.2.4 有核红细胞作为无创性材料进行产前诊断的缺点
• 1.3 孕妇外周血液中胎儿DNA 的研究进展
• 1.3.1 胎儿DNA 的发现于来源
• 1.3.2 胎儿DNA 的检测分析方法
• 1.3.3 胎儿DNA 与甲基化
• 1.3.4 胎儿DNA 的清除
• 1.3.5 胎儿DNA 在无创性产前诊断中的应用
• 1.3.6 胎儿DNA 研究应用前景
• 1.4 孕妇外周血液中胎儿RNA 的发现及其研究应用前景
• 1.4.1 胎儿RNA 发现
• 1.4.2 胎儿RNA 的稳定性
• 1.4.3 胎儿RNA 的应用前景
• 1.4.4 胎儿RNA 研究的限制因素及解决方法
• 1.5 基因芯片技术的研究进展及其应用现状
• 1.5.1 基因芯片的基本原理与操作
• 1.5.2 基因芯片的应用
• 第二章 孕妇血浆中胎儿核酸提取方法的研究
• 2.1 核酸提取纯化的研究进展
• 2.1.1 核酸分离纯化的策略
• 2.1.2 目前常用的核酸分离方法
• 2.2 甲醛处理提高胎儿DNA 在血浆总DNA 中的相对含量
• 2.2.1 研究对象
• 2.2.2 材料方法
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.4 分析讨论
• 2.2.5 结论
• 2.3 改良Trizol 法提取孕妇外周血浆中游离RNA 的比较
• 2.3.1 研究对象
• 2.3.2 材料方法
• 2.3.3 实验结果
• 2.3.4 讨论分析
• 2.3.5 结论
• 第三章 微乳液多重PCR 技术
• 3.1 引言
• 3.1.1 PCR 及多重PCR 的研究现状和进展
• 3.1.2 多重PCR 在生物医学中的应用
• 3.1.3 多重PCR 的技术难点、要点和最新进展
• 3.1.4 乳液的概念及其研究应用
• 3.1.5 本章的主要研究内容
• 3.2 微乳液（W/O）的制备及热稳定性研究
• 3.2.1 实验材料方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.3 小结
• 3.3 微乳液中进行PCR 和多重PCR 扩增的研究
• 3.3.1 研究对象
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.3 实验结果与分析
• 3.3.4 小结
• 3.4 微乳液中多重PCR 在无创性产前诊断中的应用－即Y 染色体微缺失的诊断
• 3.4.1 研究对象
• 3.4.2 材料方法
• 3.4.3 实验结果分析
• 3.4.4 小结
• 3.5 本章小结
• 第四章 基因芯片技术检测胎儿DNA
• 4.1 引言
• 4.1.1 产前诊断和胎儿DNA
• 4.1.2 基因芯片及其应用
• 4.1.3 本章的主要研究内容
• 4.2 基因芯片检测血浆DNA 用于胎儿性别鉴定的研究
• 4.2.1 研究对象
• 4.2.2 材料方法
• 4.2.3 实验结果分析
• 4.2.4 小结
• 4.3 基因芯片定量检测血浆DNA 用于产前诊断的研究
• 4.3.1 研究对象
• 4.3.2 材料方法
• 4.3.3 实验结果分析
• 4.3.4 小结
• 4.4 本章小结
• 第五章 基于基因芯片的半定量分析方法检测胎儿RNA
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料方法
• 5.2.1 试剂仪器
• 5.2.2 样品准备
• 5.2.3 几种基因芯片方法定量检测RNA 的设计
• 5.2.4 胎儿RNA 的线性扩增
• 5.2.5 定量基因芯片技术检测孕妇外周血液中胎儿RNA
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 几种不同实验方案检测RNA 芯片图
• 5.3.2 改良的RNA 线性扩增后定量PCR 检测结果
• 5.3.3 RNA 线性扩增和芯片杂交检测孕妇外周血液中胎儿RNA 的结果
• 5.4 分析讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 孕妇血浆DNA 甲基化的初步研究
• 6.1 DNA 甲基化概述
• 6.1.1 甲基化概述
• 6.1.2 DNA 甲基化与胎儿DNA
• 6.1.3 甲基化的分析方法
• 6.1.4 本章的主要研究内容
• 6.2 利用基因芯片检测孕妇血浆中APC 基因甲基化模式的研究
• 6.2.1 引言
• 6.2.2 材料方法
• 6.2.3 实验结果
• 6.2.4 分析讨论
• 6.3 本章小结
• 第七章 总结与展望
• 7.1 核酸检测分析方法的建立
• 7.1.1 微乳液多重PCR 技术
• 7.1.2 高通量检测方法的建立
• 7.1.3 存在的问题
• 7.2 胎儿核酸检测分析方法在无创性产前诊断中的初步应用
• 7.2.1 基因芯片在胎儿早期性别鉴定中的应用
• 7.2.2 基因芯片半定量分析孕妇外周血浆中胎儿相关的基因
• 7.2.3 基因芯片检测分析孕妇外周血浆DNA 的甲基化
• 参考文献
• 附录
• 致谢