β-氨基酸对映体的分离、分析和制备

论文摘要

由β-氨基酸构成的拟多肽即β-肽的药理活性和构效关系的研究是近年来药物科学领域的热点问题之一。将β-氨基酸引入多肽结构中,克服了α-肽易被蛋白水解酶降解、口服可获性低等缺陷,β-肽显示出抑制代谢的活性、具有更加稳定的二级结构且与目标酶和受体显示更强的亲和力。β-肽对映异构体在体内可能表现出不同的药理活性和药代动力学性质。为了研究单一对映体的药理行为和代谢途经,首先必须获得β-肽的单一对映体。如果合成β-肽的消旋体再进行拆分,β-肽为大分子物质较难拆分;如果对其中间体β-氨基酸进行拆分,由于β-氨基酸为小分子物质且含有酸性和碱性基团,可选择的分离分析模式多、方法简便,得到的单一对映体再制备β-肽就较简单易行。在本论文中我们分别采用毛细管电泳法和高效液相色谱法这两种高效、简便、快速且应用最广泛的拆分手段,对β-氨基酸外消旋体进行了手性拆分并对其拆分机理进行了探讨,而且实现了制备,并在此基础上初步探索了化学法和酶法拆分β-氨基酸。为了快速测定消旋体中的对映体比例,我们首先建立了β-氨基酸的毛细管电泳手性分离分析方法。以酒石酸为原料,经过酯化、酰胺化、环合、脱酰胺保护等步骤合成了手性拆分试剂18-冠-6-四羧酸（18C6H4）。基于在低pH时氨基酸对映体以伯胺离子形式与18C6H4形成的两种非对映体络合物,在毛细管电泳的条件下,两者具有不同的迁移时间而得以分离。以手性冠醚为手性添加剂的毛细管电泳法成功地用于五种β-氨基酸对映体的分离,分离因子高达1.08。实验结果表明,该方法快速、简便,可以用于非色谱法拆分β-氨基酸的监测方法。发展了β-氨基酸的高效液相色谱手性分离分析方法。首先在流动相中加入光学纯L-α-氨基酸作为手性配体,通过流动相中Cu2+与β-氨基酸的D-和L-型对映体形成两种非对映体的络合物平衡常数的差别,在反相液相色谱系统中可实现β-氨基酸对映体的拆分。该法选择性高,但系统平衡慢、基线波动大、色谱柱易堵塞。为了克服上述弊端,我们将L-α-氨基酸键合于硅胶上,制备了手性配体交换色谱固定相,用于β-氨基酸对映体的分离。结果表明该方法可实现β-氨基酸对映体的快速定性、定量分析,还可用于对映体的制备分离。进一步研究了配体交换快速色谱制备β-氨基酸对映体的方法。选用以阳离子交换树脂和十八烷基键合硅胶为吸附剂的固相萃取法从色谱流出液组分中除Cu2+,并优化了纯化条件。本文还对非色谱法如化学成盐法和酶法拆分β-氨基酸进行了初步的摸索,但是未取得成效,有待进一步筛选成盐手性拆分试剂和酶。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 自然界存在的结构中包含β-氨基酸的分子
• 1.1.1 结构中包含β-氨基酸的分子
• 1.1.2 结构中包含α-烷基-β-氨基酸的分子
• 1.1.3 结构中包含α-羟基-β-氨基酸的分子
• 1.2 β-氨基酸在哺乳动物体内的代谢
• 1.2.1 R-β-氨基异丁酸的代谢
• 1.2.2 S-β-氨基异丁酸的代谢
• 1.3 β-氨基酸在生物学和医药学中的应用
• 1.3.1 β-氨基酸结构的研究进展
• 1.3.2 β-氨基酸用于受体激动剂和拮抗剂
• 1.3.3 β-氨基酸用于蛋白酶抑制剂
• 1.3.4 β-氨基酸用于抗菌
• 1.4 β-氨基酸的不对称合成
• 1.4.1 天然手性化合物衍生化法
• 1.4.2 应用手性辅基控制的不对称合成
• 1.4.3 不对称催化法
• 1.4.4 酶拆分法
• 1.5 β-氨基酸对映体的分离分析
• 1.5.1 高效液相色谱法
• 1.5.2 毛细管电泳法
• 1.5.3 气相色谱法
• 1.6 论文研究的目标和内容
• 第二章 实验部分
• 2.1 实验原料、试剂和仪器
• 2.1.1 原料与试剂来源
• 2.1.2 样品结构及来源
• 2.1.3 实验材料、仪器及来源
• 2.2 手性冠醚的合成及其应用
• 2.2.1 （-）-18-冠-6-四羧酸的合成
• 4作为手性添加剂用于 CE 拆分 β-氨基酸对映'>2.2.2 18C6H₄作为手性添加剂用于 CE 拆分 β-氨基酸对映
• 2.2.3 反应中间体用于CE 拆分β-氨基酸
• 4 和β-氨基酸对映体结合常数的测定'>2.2.4 18C6H₄和β-氨基酸对映体结合常数的测定
• 2.3 手性配体交换色谱分离β-氨基酸对映体
• 2.3.1 手性流动相添加法分离β-氨基酸对映体
• 2.3.2 共价键合型手性固定相法分离β-氨基酸对映体
• 2.3.3 配体交换手性色谱用于其他化合物对映体的分离
• 2.4 β-氨基酸对映体的快速色谱制备分离及其固相萃取法纯化
• 2.4.1 配体交换手性固定相的制备
• 2.4.2 配体交换手性固定相的表征
• 2.4.3 β-氨基酸消旋体的快速色谱制备分离
• 2.4.4 固相萃取法（SPE）除铜
• 2.5 化学成盐法拆分β-氨基酸对映体
• 2.5.1 DL-β-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的合成
• 2.5.2 二苯甲酰-D-酒石酸的合成
• 2.5.3 DL-β-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的化学拆分
• 2.6 酶法拆分β-氨基酸对映体
• 2.6.1 N-乙酰-DL-β-苯丙氨酸的合成
• 2.6.2 N-乙酰-DL-β-苯丙氨酸的酶法拆分
• 第三章 手性添加剂法毛细管电泳分离β-氨基酸对映体
• 引言
• 4）的合成'>3.1 （-）-18-冠-6-四羧酸（18C6H₄）的合成
• 3.1.1 （S,S）-（-）-酒石酸二乙酯的制备
• 3.1.2 （S,S）-（-）-N,N,N',N'-四甲基酒石酸二酰胺的制备
• 3.1.3 二甘醇二对甲苯磺酸酯的制备
• 3.1.4 （2S,3S,11S,12S）-（-）-18-冠-6-2,3,11,12-四甲酰胺的制备
• 3.1.5 （2S,3S,11S,12S）-（-）-18-冠-6-2,3,11,12-四甲酸的制备
• 6H₄ 作为手性添加剂用于分离β-氨基酸对映体'>3.2 18C₆H₄作为手性添加剂用于分离β-氨基酸对映体
• 6H₄ 浓度对分离的影响'>3.2.1 18C₆H₄浓度对分离的影响
• 3.2.2 缓冲液pH 值对分离的影响
• 3.2.3 缓冲液中胺对分离的影响
• 3.2.4 有机改性剂对分离的影响
• 3.2.5 运行电压对分离的影响
• 3.2.6 手性冠醚的回收
• 3.3 反应中间体用于CE 拆分β-氨基酸消旋体
• 4和β-氨基酸的结合常数的测定'>3.4 18C6H₄和β-氨基酸的结合常数的测定
• 3.4.1 淌度移动法测定结合常数的原理
• 4 与β-氨基酸对映体结合常数'>3.4.2 淌度移动法测定18C6H₄与β-氨基酸对映体结合常数
• 3.5 拆分机理探讨
• 3.5.1 冠醚络合机理
• 4的手性拆分机理'>3.5.2 18C6H₄的手性拆分机理
• 3.5.3 β-氨基酸结构对分离的影响
• 3.5.4 β-氨基酸结构对结合常数的影响
• 3.6 小结
• 第四章 手性配体交换色谱法分离β-氨基酸对映体
• 引言
• 4.1 手性流动相添加法分离β-氨基酸对映体
• 4.2 β-氨基酸对映体对映体的键合型手性配体交换色谱分离
• 4.2.1 硅胶基质对分离的影响
• 4.2.2 手性选择体对分离的影响
• 4.2.3 流动相pH 值对分离的影响
• 4.2.4 中心金属离子浓度对分离的影响
• 4.2.5 流动相阴离子对分离的影响
• 4.2.6 固定相疏水基团对分离的影响
• 4.2.7 手性固定相的使用寿命
• 4.3 键合型手性配体交换色谱用于其他化合物对映体的分离
• 4.4 拆分机理讨论
• 4.4.1 手性配体交换色谱拆分机理
• 4.4.2 β-氨基酸对映体分离机理的初步探讨
• 4.4.3 CMPA 和CSP 对β-氨基酸对映体分离的比较
• 4.4.4 涂敷型和键合型CSP 对β-氨基酸对映体分离的比较
• 4.5 小结
• 第五章 β-氨基酸对映体的快速色谱制备分离及其固相萃取法纯化
• 引言
• 5.1 β-氨基酸消旋体的快速色谱制备分离
• 5.1.1 硅胶粒径对分离的影响
• 4 浓度对分离的影响'>5.1.2 淋洗液CuSO₄浓度对分离的影响
• 5.1.3 样品体积对分离的影响
• 5.2 固相萃取法除铜
• 5.2.1 强酸型阳离子交换树脂SPE 除铜
• 5.2.2 十八烷基键合硅胶SPE 除铜
• 5.2.3 基于螯合机理除铜的前期工作
• 5.3 讨论
• 5.3.1 快速色谱的特点
• 5.3.2 键合型和涂敷型CSP 用于快速色谱的比较
• 5.3.3 两种除铜方法的特点
• 5.4 小结
• 第六章 化学法和酶法拆分β-氨基酸
• 6.1 化学法拆分β-氨基酸
• 6.2 酶法拆分β-氨基酸
• 6.3 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 全文结论
• 7.2 工作展望
• 参考文献
• 附录
• 发表论文及参加科研情况说明
• 致谢