ChIFN-α/ChIL-2嵌合基因的构建、融合表达及生物学活性研究

论文摘要

鸡的病毒性疾病种类多、危害大,当前,缺乏高效广谱的抗病毒药物可用;为了研究高效、广谱、无残留、无污染、不产生耐药性的基因工程抗病毒药物,解决当前兽医临床上无高效广谱抗病毒药物可用的技术问题,本研究进行了鸡α干扰素/白细胞介素2嵌合基因的构建、融合表达及生物学活性研究。首先设计含双酶切位点的引物采用RT-PCR方法自罗曼鸡脾脏总RNA扩增、克隆鸡白细胞介素-2（Chicken interleukin-2, ChIL-2）成熟肽基因;采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR）技术将鸡α干扰素（chicken interferon alpha, ChIFN-α）和ChIL-2成熟肽基因序列通过一基因柔性linker （G4S）3连接,构建重组嵌合基因（ChIFN-α-linker-ChIL-2）并克隆入pGEM-T easy克隆载体,筛选ChIFN-α-linker-ChIL-2、ChIL-2阳性重组质粒并经限制性内切酶双切后连接入经相同酶切的pQE-30表达载体中以构建重组表达载体pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2、pQE-30/ChIL-2,将以上重组表达载体及以前已构建成功的pQE-30/ChIFN-α转化入E. coli. JM109中并采用IPTG诱导表达。分别对表达的重组ChIFN-α蛋白（rChIFN-α）、重组ChIL-2蛋白（rChIL-2）、重组融合ChIFN-α-linker- ChIL-2蛋白（rChIFN-α-linker-ChIL-2）采用尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等方法进行纯化。采用细胞病变抑制法分别检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、单一rChIFN-α蛋白在鸡胚成纤维细胞（Chicken Embryo Fibroblasts,CEF）上抗水泡性口炎病毒（VSV）活性;采用MTT法和ChIL-2 ELISA试验方法分别检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中rChIL-2的含量、单一ChIL-2蛋白对ConA刺激的鸡T淋巴细胞增殖活性及与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫强毒株（NDV）和禽流感H9N2株（ AIV H9N2 ）抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的抗病毒活性及ChIL-2蛋白的疫苗免疫增强活性。结果表明:克隆了ChIL-2成熟肽基因,全长363bp,编码121个氨基酸;表达的rChIL-2蛋白分子量大小约为16.3 kD左右;经纯化后蛋白纯度在95%以上。采用SOE-PCR方法成功构建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因及其pQE-30重组表达载体（ pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2 ）,对其测序结果表明重组表达质粒中插入的ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因全长909bp,编码300个氨基酸,插入方向正确,核苷酸序列无变异。表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9 kD,与预期大小相一致;蛋白经纯化后纯度在96%以上。活性研究结果表明:rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上具有明显的抗病毒活性,其在CEF细胞上的抗VSV活性单位（9.36×107IU/mg）,明显高于单一rChIFN-α的抗病毒效价（4.09×105 IU/mg）。最低剂量为250pg的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可对Con A活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,随着剂量的增加,rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对鸡T淋巴细胞的增殖活性逐渐增强;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应,计算rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2蛋白的相对含量约为8.12×10-7mg/mL,说明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIL-2蛋白具有免疫学生物活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显减轻NDV强毒株和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡胚内具有明显的抗病毒活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用,但对NDV活疫苗免疫增强作用不明显,表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内既具有抗病毒活性,同时也具有IL-2的免疫增强作用。以上结果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性。本研究成功构建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因,并对其进行了融合表达和纯化;纯化后的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上和鸡体内均具有抗病毒活性和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,在鸡胚内具有明显的抗病毒活性。本研究为鸡基因工程抗病毒制剂的研发及鸡病毒性疾病的防制等研究奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 前言
• 一、文献综述
• 二、正文部分
• 第一章 鸡白细胞介素 2 的克隆、表达及活性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 ChIFN-α-Linker-ChIL-2 嵌合基因的构建、融合表达及纯化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 重组 ChIFN-α-Linker-ChIL-2（rChIFN-α-Linker-ChIL-2） 蛋白的生物学活性测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 三、结论
• 四、创新点
• 附录
• 参考文献
• 英文摘要