急性心肌梗死经骨髓间充质干细胞移植前后Cx43、Cx45与心电生理变化的实验研究

论文摘要

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction, AMI）是严重危害中老年人身体健康的常见病。目前对AMI的治疗方法如冠状动脉旁路移植术等,虽然能恢复再灌注,却不能逆转已坏死的心肌,而心肌细胞的缺失可导致心力衰竭甚至死亡。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化潜能,容易获取和分离培养,扩增能力强,已成为心肌梗死（MI）治疗的研究热点。缝隙连接（Gap junction, GJ）是由缝隙连接蛋白（Connexins, Cx）构成的细胞间通道膜结构,介导相邻细胞间电和化学信号的传递。它们由缝隙连接蛋白组成。Cx43是成年哺乳动物心室工作细胞中主要的Cx,而Cx45则在心室的特定部位如传导系统中表达。既往的研究发现,MI后Cx43数量下降和分布紊乱使得局部传导阻滞和折返性心律失常易于发生。近来的研究发现Cx45可能在缺血性心脏病中起着调控Cx43通道的作用。尽管MSCs的体外培养和诱导可以表达心肌特异的收缩蛋白及缝隙连接蛋白,但是,MSCs移植入体内后能否长期存活并改善局部功能,是否有致心律失常作用,能否持续表达Cx43或Cx45并与宿主心肌细胞形成有效连接,移植后对宿主心肌的Cx43和Cx45的表达有何影响,这些问题相关的研究甚少且有待更多的基础研究去回答。本研究采用同种异体MSCs经体外诱导和标记后行心脏局部注射,观察MSCs在宿主心肌的存活时间和对宿主心脏功能的影响,并观察MSCs移植是否对MI后心律失常的发生基质具有改善作用,同时在基因水平和蛋白水平系统观察移植的MSCs表达Cx的情况及对宿主心肌Cx43和Cx45的表达有何影响。本研究分为四个部分。研究一同种异体骨髓间充质干细胞的分离、培养、诱导和鉴定的研究目的从新生大鼠的骨髓中分离出MSCs,进行体外培养、诱导和鉴定,探讨MSCs向心肌细胞定向分化的潜能,为MSCs移植治疗MI奠定基础。方法抽取Wistar大鼠骨髓液,采用密度为1.073的percoll细胞分离液,通过密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,利用细胞贴壁筛选法纯化MSCs;以含10%胎牛血清（FBS）的L-DMEM培养基添加青霉素和链霉素于37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵箱中培养,以10μmol/L的5-溴脱氧尿核苷（5-aza）进行体外诱导成心肌样细胞并进行α-肌动蛋白（α-actin）、心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）和缝隙连接蛋白（Cx43）免疫组化鉴定,同时行透射电镜观察肌丝等细胞超微结构。结果MSCs通过密度梯度离心法与贴壁培养法分离后,在含10%FBS的L-DMEM培养基中生长良好。体外培养24小时后即可贴壁生长,7～10天细胞迅速增殖,10～12天基本铺满瓶底。传代后MSCs分布较均匀,呈扁平多角形、三角形和梭形等多种形态,排列密集。经10μmol/L的5-aza诱导4周后,MSCs可分化为形态均一的长梭形心肌样细胞,排列方向趋于一致,偶可见自发搏动的细胞,搏动频率10～20次/分,行免疫组化染色示α-actin、cTnT和Cx43阳性表达。电镜观察示诱导后横纹样结构形成,胞质中有富集的糖原颗粒及肌丝形成。结论MSCs体外易于分离、纯化和长期培养。诱导可分化为自发搏动的心肌样细胞,表达α-actin、cTnT和Cx43并形成肌丝结构。说明MSCs具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能,可作为移植治疗MI的理想的细胞来源。研究二骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究目的建立稳定的MI大鼠模型,MSCs体外标记后移植,观察MI大鼠经MSCs移植后左室功能和病理的变化。方法Wistar大鼠随机分为4组,正常对照组（Nor组）、假手术组（Sham组）、心肌梗死+生理盐水组（MI组）和MSCs移植组（MSCs组）,每组45只。提前抽取同种异体大鼠骨髓,体外扩增MSCs达1×107,加入10μmol/L的5-aza诱导成心肌样细胞,进行长期传代和培养。MSCs移植前加入0.04%的4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行标记。MI组和MSCs组开胸直视下,结扎冠状动脉左前降支（LAD）,制作AMI模型;Sham组只开胸不结扎。一周后大鼠二次开胸,MSCs组于直视下将标记有DAPI的MSCs （2×106/100μl）分多点注射到MI的边缘区和中心区;MI组注射等量生理盐水;Sham组只开胸未行注射。干预后（MSCs移植术后）4、8和12周采用彩色多普勒超声心动图仪（UCG）检测左室舒张末期内径（LVIDd）,左室收缩末期内径（LVIDs）,左室射血分数（EF）和左室短轴缩短率（FS）。完成检查后,取出心脏行病理切片,采用病理图象分析系统观察各组梗死面积的百分比。取部分新鲜的左心室组织行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记的MSCs迁移、分布情况。结果⑴采用开胸结扎LAD的方法可有效建立大鼠AMI模型,MI组和MSCs组大鼠7天存活率为87.8%。行二次开胸细胞移植术,MI组总存活率为68.9%,MSCs组总存活率为80.0%。MSCs移植前DAPI的标记率达100%。⑵心脏彩超结果示,MI组干预后各周的LVIDd和LVIDs显著增加,EF和FS则显著下降;与MI组相比,MSCs组干预后各周的LVIDs减小,EF和FS则显著增加。随着干预时间的延长,MI组和MSCs组的LVIDd和LVIDs均持续增加,而EF和FS则持续下降。⑶梗死面积百分比测量显示,干预后4周MSCs组和MI组无统计学差异,而干预后8周和12周的梗死面积百分比则显著小于MI组。MI组和MSCs组均有梗死面积百分比随着梗死时间的延长而增加的趋势。⑷干预后4周,荧光显微镜下观察梗死边缘区（缺血区）可见DAPI标记带蓝色荧光的MSCs细胞核,呈小岛样分布且较广泛,形态规则,呈椭圆形类似心肌细胞核。随着移植时间的延长,8周和12周在荧光显微镜下仍可见蓝色荧光的DAPI标记,但强度逐渐减弱。结论采用开胸结扎LAD的方法可建立稳定的AMI大鼠模型。同种异体MSCs移植可在宿主心肌里存活,并有效改善MI后左室功能,减小梗死面积。研究三骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死后心电生理的影响目的探讨MSCs移植对AMI后心电生理的影响,为进一步研究MSCs移植与心律失常的关系建立基础。方法Wistar大鼠随机分为4组,正常对照组（Nor组）、假手术组（Sham组）、心肌梗死+生理盐水组（MI组）和MSCs移植组（MSCs组）,每组45只。以上各组按干预后4、8和12周又分为3个亚组,每亚组15只大鼠。各亚组于MSCs移植术后4、8和12周分别行:⑴标准的6肢体导联体表ECG测定,记录ECG各参数。⑵心室有效不应期（VERP）和室颤阈值（VFT）的测定。开胸后在心外膜相应区域置入1对鱼钩状电极,电极连接心脏电生理刺激仪,心电图机记录标准2导联心电图。行4:1的S1S2负向扫描法测定VERP;行间断S1S1刺激法测定VFT;同时观察并记录程序刺激过程中所诱发的室性心动过速（室速）的数量和类型。结果⑴与Sham组相比,MI组各周ECG的PR间期、QRS时限、QT间期及QTc间期等均明显延长,VERP增加,VFT减小。与MI组相比,MSCs组干预后各周的PR间期、QRS时限和VERP缩短而VFT增加。不同周数间的比较,随着干预时间的延长,MI组和MSCs组的ECG各参数以及VERP和VFT均无统计学差异。⑵Nor组和Sham组室速诱发率无统计学差异（8.9% vs. 11.1%）;MI组室速诱发率高于Sham组（37.8% vs. 11.1%,P<0.01）,MI组和MSCs组室速诱发率无明显差异（37.8% vs. 26.7%）。结论同种异体MSCs移植能改善MI大鼠的电生理异常状况,有利于心电稳定。研究四骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死后缝隙连接蛋白43、45的影响目的探讨经5-aza体外诱导后的MSCs移植对MI后Cx43/Cx45重构的影响及其与心律失常的关系。方法Wistar大鼠随机分为4组,正常对照组（Nor组）、假手术组（Sham组）、心肌梗死+生理盐水组（MI组）和MSCs移植组（MSCs组）,每组45只。以上各组按干预后4、8和12周又分为3个亚组,每亚组15只大鼠。各亚组于MSCs移植术后4、8和12周分别行:⑴提取组织RNA,荧光PCR检测Cx43mRNA和Cx45mRNA。⑵制备左心室石蜡纵向切片,采用免疫组化间接染色法染色。Cx43和Cx45分别采用DAB显色系统和AEC显色系统进行免疫显色。采用Image Pro Plus 6.0图象分析系统进行Cx43和Cx45蛋白的半定量分析。⑶制备左心室冰冻切片和石蜡纵向切片,采用免疫荧光双染色法染色。Cx43和Cx45分别采用FITC标记的荧光抗体和TR标记的荧光抗体进行免疫显色。采用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察DAPI标记的MSCs移植后迁移、分布及分化情况;采用LSCM观察Cx43和Cx45的荧光信号分布特点,并进行Cx43和Cx45蛋白的定量分析。⑷制备左心室新鲜标本,予电镜专用固定液固定后行超微切片,采用胶体金标记的抗体分别进行Cx43和Cx45的免疫标记,透射电镜下观察心肌、润盘、缝隙连接等超微结构的变化,以及缝隙连接上胶体金标记的Cx43和Cx45阳性表达情况。结果⑴LSCM观察可见DAPI标记带蓝色荧光的移植MSCs细胞核,呈小岛样分布且较广泛,随着移植时间的延长荧光强度逐渐减弱。同一切片的多通道的激发光观察发现移植的MSCs可表达Cx43。⑵荧光PCR、免疫组化、免疫荧光及免疫电镜的检测结果均显示,干预后4、8和12周,MI组和MSCs组的缺血区Cx43mRNA和Cx43蛋白均较正常区显著减少,而梗死区Cx43mRNA和Cx43蛋白则显著低于缺血区;与MI组相比,MSCs组缺血区Cx43mRNA和Cx43蛋白显著增高,而梗死区Cx43mRNA和Cx43蛋白与MI组无统计学差异。干预后4、8和12周,MI组和MSCs组缺血区Cx45mRNA和Cx45蛋白较正常区增加;与MI组缺血区相比,MSCs组缺血区Cx45mRNA和Cx45蛋白减少。两组梗死区均无Cx45mRNA和Cx45蛋白表达。⑷MI组4、8和12周的正常区未发现明显的Cx43/Cx45共表达区域,而8周和12周的缺血区可发现较明显的Cx43/Cx45共表达区域。MSCs组4、8和12周的正常区和缺血区未发现明显的Cx43/Cx45共表达区域。结论⑴DAPI标记的同种异体MSCs移植可在宿主心肌里存活,表达Cx43。⑵MI后Cx重构,如Cx43mRNA和Cx43蛋白下降,Cx45mRNA和Cx45蛋白上调以及Cx43/Cx45区域性共表达,构成异常电生理基质,均使心肌间电传导各向异性的非均一性增加、心电不稳定。⑶MSCs移植可以在一定程度上改善MI后Cx重构,改善心肌间电传导各向异性的非均一性,有利于心电稳定。

论文目录

• 主要英文缩写索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 实验路线图
• 第一部分 同种异体骨髓间充质干细胞的分离、培养、诱导和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究
• 一、大鼠急性心肌梗死模型的建立
• 材料与方法
• 结果
• 二、骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死后心电生理的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第四部分 骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死后Cx43、Cx45 的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 全文小结
• 综述一
• 综述二
• 论文发表登记
• 致谢