猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫原性分析

论文摘要

一、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ融合蛋白的纯化及其间接ELISA检测方法的建立将猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,App）毒素ApxⅡ的融合表达质粒pET-ApxⅡ转化到BL21（DE3）,筛选高表达的克隆子用于诱导表达。应用亲和层析纯化ApxⅡ作为抗原包被ELISA板建立检测App的ApxⅡ-ELISA试剂盒。试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为10μg/mL,血清1:80稀释;一抗反应时间为90min,二抗反应时间为45min。与Cps-ELISA试剂盒平行检测172份临床血清显示该试剂盒具有良好的稳定性和重复性,并具有较高的特异性和敏感性。二、猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白A（OmlA）部分基因片段的克隆表达参照GenBank中App血清1、2、7型菌株的OmlA序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增外膜脂蛋白A（OmlA）部分基因,分别得到994bp、1003bp和1000bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中。经测序比较,与GenBank中公布的序列（AB007572、AB007573和AB007579）核苷酸同源性分别为100%。从T载体中切下目的片段后,定向克隆到pET32a（+）中,转化BL21（DE3）。经诱导后,进行SDS-PAGE实验,证明获得56kDa的融合蛋白,目的基因高效表达;免疫转印鉴定呈阳性,外膜蛋白OmlA部分基因片段体外成功表达。三、猪胸膜肺炎放线杆菌共同的外膜蛋白（AopA）部分基因片段的克隆表达参照GenBank中App的外膜蛋白AopA基因序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增外膜蛋白A（AopA）部分基因,得到1390bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中,经测序比较,与GenBank中公布的序列（U24492）核苷酸同源性为99%。从T载体中切下目的片段后,定向克隆到pET32a（+）中,转化BL21（DE3）,经诱导后,进行SDS-PAGE实验,证明获得69kDa融合蛋白,目的基因高效表达;免疫转印鉴定呈阳性,外膜蛋白AopA部分基因片段体外成功表达。四、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白ICR小鼠免疫试验通过基因工程技术分别表达了App的外膜蛋白rAopA、rOmlA1、rOmlA2和rOmlA7,分别免疫60只ICR小鼠,同时与rApxⅡ组合免疫96只ICR小鼠;三免后分别用最小致死剂量的Appl型菌（2×107CFU）和App7型菌（4×108CFU）攻毒。结果显示,试验组保护效果优于对照组;rOmlA7和rAopA与rApxⅡ组合免疫组的保护效果优于其他试验组和对照组,其中rOmlA7组合免疫的小鼠在抵抗Appl型菌攻击能力优于rOmlAl组合。试验证实App的外膜蛋白具有免疫原性,在抵抗App的攻击中起到一定的保护作用,且App的OmlA可能还可以提供交叉免疫保护。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 1 引言
• 2 病原学
• 3 流行病学
• 4 致病机理
• 5 毒力因子
• 6 临床症状与病理变化
• 7 检测技术的研究进展
• 8 防治策略
• 参考文献
• 第二篇 研究论文
• 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ融合蛋白纯化及其间接ELISA检测方法的建立
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白A（OmlA）部分基因片段的克隆表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪胸膜肺炎放线杆菌共同的外膜蛋白（AopA）部分基因片段的克隆表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白ICR小鼠免疫试验
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢