论文摘要
缺血性脑卒中是危害人类生命和健康的常见病。在既往报道的大量缺血性脑卒中病例中仅有少数患者能完全恢复,而极大多数患者残留有不同程度的功能障碍,主要表现为肢体功能障碍,失语,口眼歪斜,吞咽困难,思维迟钝,记忆减退,心理障碍,人格变性等。严重的后遗症可伴随患者持续加重直至死亡,给患者本人带来极大的痛苦,也给患者家庭和社会造成了极大的经济负担。但迄今为止,缺血性脑卒中尚无特殊的良效药物治疗,尤其是对错过最佳治疗时间窗（6h以内,溶栓治疗）的缺血性脑卒中的治疗全世界还没有一个完全统一的标准。中药治疗缺血性脑卒中的疗效是肯定的,作用广泛且具有毒副作用小,适合长期服用,成本低等优点。因此,发掘中医药宝库,创新缺血性脑卒中治疗理论,寻找促进缺血性脑卒中患者神经功能的恢复并开发有益于受损神经功能修复的中药制剂,已经倍受国内外的关注。梓醇为中药来源的活性单体化合物,具有显著的脑保护作用：梓醇腹腔注射给药对急性脑缺血损伤动物具有良好的神经保护作用。梓醇对脑神经良好的保护作用,使其成为潜在的治疗脑血管病的药物。因此,针对梓醇对缺血性脑损伤动物的作用结合临床缺血性脑卒中的特点,考虑将其开发成口服制剂用于改善缺血性脑卒中患者神经功能障碍。本论文在文献报道和预实验的基础上,结合脑缺血急性期病理机制和脑缺血恢复早期的病理生理变化特点,采用大鼠（1）永久性大脑中动脉缺血模型；（2）大脑中动脉缺血-再灌注模型,观察梓醇对缺血性脑损伤动物恢复早期（脑缺血后3-14d）神经功能障碍的改善作用,并探讨脑缺血损伤及修复过程中梓醇对缺血周围区大脑皮层病理变化、细胞凋亡、神经元修复的干预作用,为其缺血性脑卒中疾病的临床应用提供实验依据,同时也为缺血性脑卒中最佳治疗时间窗之外的中药干预时机的合理性进行探索。本论文主要分为三个部分：第一章梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期神经功能的影响及其机制研究第一节梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠神经功能及其神经元病理改变的影响目的：探讨梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期神经功能的影响以及对神经元的保护和修复作用。方法：线栓法制备大鼠永久性局灶性大脑中动脉缺血（pMCAO）模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组,依达拉奉7mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后3、7、10、14d进行神经功能行为学评分,横木行走实验,触觉刺激实验,抓握力量实验,观察神经功能的动态变化；缺血后14d,用HE染色及尼氏染色观察缺血周围区大脑皮质神经元的病理改变,电镜观察缺血周围区大脑皮质超微结构变化。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠的神经功能明显损伤；与模型组比较,缺血后14d,梓醇30、60mg/kg给药组大鼠神经功能行为学评分明显降低,横木行走能力明显增强,触觉刺激敏感度恢复明显,揭除胶布的潜伏期明显缩短,抓握力量显著增加,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。缺血后14d,与假手术组比较,缺血组大鼠缺血周围区大脑皮层的神经元细胞明显损伤,与模型组比较,梓醇30.60mg/kg给药组增加大鼠缺血周围区大脑皮层完整神经细胞的数量,增加缺血周围区大脑皮层神经元尼氏小体的表达,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。与假手术组比较,模型组缺血周围区大脑皮层神经元内细胞器稀疏、多聚核糖体解聚,高度肿胀、线粒体嵴断裂或空泡化,双膜结构模糊或外膜破裂、高尔基体扩张呈大泡状；细胞核固缩；毛细血管内皮细胞肿胀；轴索髓鞘泡鼓、分层,轴索变性等。给药组缺血周围区大脑皮层结构损伤程度减轻,神经元的粗面内质网、线粒体、多聚核糖体基本正常；毛细血管内皮细胞轻度肿胀,基膜基本完整；轴突内微管、微丝保存良好等。结论：梓醇可促进大鼠脑缺血损伤后神经功能障碍的恢复,可能与其减轻神经元病理及超微结构损害,对神经元有良好的保护和修复作用有关。第二节梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠细胞凋亡的影响目的：探讨梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期神经细胞凋亡的影响。方法：线栓法制备大鼠pMCAO模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组,依达拉奉7mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后14d,运用TUNEL法检测缺血周围区大脑皮质神经细胞的凋亡,免疫组化法检测缺血周围区大脑皮质Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：假手术组未见细胞凋亡,而模型组缺血周围区大脑皮质可见大量的凋亡阳性细胞表达,梓醇给药干预能明显减少凋亡阳性细胞数（p<0.05,p<0.01）。与假手术组比较,模型组缺血周围区大脑皮质抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降,促凋亡蛋白Bax的表达明显增加,梓醇给药干预可显著的升高Bcl-2的表达、抑制Bax的表达,明显的降低Bax/Bcl-2的比值（p<0.05,p<0.01）。结论：在脑缺血周围区大脑皮层,梓醇给药治疗,通过促进Bcl-2表达,抑制Bax表达,降低Bax/Bcl-2比值,减少神经细胞凋亡,从而发挥神经细胞保护作用。第三节梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠神经营养因子的影响目的：探讨梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期神经营养因子表达的影响。方法：线栓法制备大鼠pMCA0模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组;丁苯酞70mg/kg对照组,依达拉奉7mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后14d,免疫组化法检测缺血周围区大脑皮层NGF、BDNF、GDNF、VEGF、bFGF蛋白的表达。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血周围区大脑皮层NGF、BDNF、GDNF、VEGF、bFGF蛋白的表达量均降低；与模型组比较,梓醇30mg/kg给药组能明显的增加NGF、BDNF、VEGF、bFGF蛋白的表达量,降低GDNF蛋白的表达,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。结论：梓醇可促进大鼠缺血周围区大脑皮层内源性NGF、BDNF、VEGF、bFGF的表达和释放。梓醇可能通过促进内源性NGF、BDNF、VEGF、bFGF的表达而发挥促神经元存活、修复再生的作用,进而促进神经功能障碍的恢复。第四节梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠能量代谢的影响目的：探讨梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期皮层能量代谢障碍的影响。方法：线栓法制备大鼠pMCAO模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组,依达拉奉7mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后14d,紫外-可见分光光度法检测缺血侧皮层Lac和Pyru的含量、Na+,K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase的活性。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层Lac和Pyru的含量均增加,而Na+,K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase的活性均降低；与模型组比较,梓醇给药干预能显著的降低Lac的含量而增加Pyru的含量,降低Lac/Pyru比值；显著增加Na+K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase的活性,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。结论：梓醇可促进大鼠缺血侧皮层能量代谢紊乱的恢复。梓醇可能以此减轻皮层神经细胞酸中毒和钙超载,增加神经细胞的能量供应从而促进神经元的存活、修复再生,进而促进神经功能障碍的恢复。第二章梓醇对脑缺血-再灌注损伤大鼠恢复早期神经功能的影响及其机制研究第一节梓醇对脑缺血-再灌注损伤大鼠神经功能及其能量代谢的影响目的：探讨梓醇对脑缺血-再灌注损伤大鼠恢复早期神经功能及大脑皮层能量代谢的影响。方法：线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后3、7、10、14d进行神经功能行为学评分,横木行走实验,触觉刺激实验,抓握力量实验,观察神经功能的动态变化；缺血后14d,紫外-可见分光光度法检测缺血侧皮层Lac和Pyru的含量、Na+, K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase的活性。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠的神经功能明显损伤；与模型组比较,缺血后14d,梓醇30、60mg/kg给药组大鼠神经功能行为学评分明显降低,横木行走能力明显增强,触觉刺激敏感度恢复明显,揭除胶布的潜伏期明显缩短,抓握力量显著增加,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层Lac和Pyru的含量均增加,而Na+,K+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase的活性均降低；与模型组比较,梓醇给药干预能显著的降低Lac的含量而增加Pyru的含量,降低Lac/Pyru比值；显著增加Na+,K+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase的活性,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。结论：梓醇可改善大鼠脑缺血-再灌注损伤后神经功能障碍的恢复,可能与其减轻缺血侧皮层神经元细胞酸中毒和钙超载,增加神经细胞的能量供应从而促进神经元的存活、修复再生有关。第二节梓醇对脑缺血-再灌注损伤大鼠氧化应激及其炎症反应的影响目的：探讨梓醇对脑缺血-再灌注损伤大鼠恢复早期大脑皮层氧化应激和炎症反应的影响。方法：线栓法制备大鼠MCAO再灌注模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后14d,紫外-可见分光光度法检测缺血侧皮层SOD和MDA的含量,ELISA法检测缺血侧皮层IL-6、IL-10、NF-kBp65的含量。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层SOD的含量显著降低,MDA的含量明显增加；与模型组比较,梓醇给药干预能显著的升高SOD的含量、降低MDA的活性,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层IL-10的含量明显增加,IL-6和NF-kBp65的含量接近正常范围；与模型组比较,梓醇给药干预能显著的降低IL-10的含量,差异有统计学意义（p<0.05,p<0.01）；梓醇15mg/kg给药组可明显升高IL-6的含量,显著降低NF-kBp65的含量,差异有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。结论：梓醇可降低大鼠缺血侧皮层MDA、IL-10的表达,升高SOD的活性,对IL-6和NF-kBp65的作用不明显。梓醇可能通过促进SOD的表达,抑制MDA和IL-10的表达而抑制氧化损伤和炎症损伤,从而发挥神经保护作用。第三章梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期神经保护和神经修复相关调节因子的影响第一节梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期神经保护和神经修复调节通路NGF/TrKA, BDNF/TrKB水平的影响目的：探讨梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠大脑皮层NGF、BDNF及其相应受体TrKA、TrKB蛋白和基因水平的影响。方法：线栓法制备大鼠pMCAO模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组,依达拉奉7mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后14d, Western Blot法检测缺血侧皮层NGF、TrKA、BDNF、TrKB蛋白表达；Realtime PCR法检测缺血侧皮层NGFmRNA、TrKAmRNA、BDNFmRNA、TrKBmRNA的表达水平。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层NGF、TrKA、BDNF、TrKB蛋白表达均降低,NGFmRNA、TrKAmRNA、BDNFmRNA、TrKBmRNA的表达水平均降低；与模型组比较,梓醇30mg/kg给药组能显著的升高NGF、TrKA、BDNF、TrKB蛋白及mRNA水平的表达,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。结论：梓醇可改善大鼠脑缺血损伤后神经功能的恢复,可能与其诱导脑缺血后缺血侧皮层NGF、TrKA、BDNF、TrKB蛋白及mRNA水平的上调,促进了缺血周围区神经修复的效应有关。第二节梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠恢复早期皮层PI3K/Akt信号通路PI3K、Akt水平的影响目的：探讨梓醇对永久性脑缺血损伤大鼠皮层PI3K/Akt信号通路PI3K、Akt水平的影响。方法：线栓法制备大鼠pMCA0模型,随机分为模型组；梓醇15、30、60mg/kg给药组；丁苯酞70mg/kg对照组,依达拉奉7mg/kg对照组以及假手术组。术后3-14d给药,1次/d,缺血后14d,Western Blot法检测缺血侧皮层PI3K、Akt蛋白表达；Realtime PCR法检测缺血侧皮层PI3KmRNA、AktmRNA的水平。结果：缺血后14d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层PI3K、Akt蛋白表达均降低,PI3KmRNA表达水平升高,AktmRNA表达水平降低；与模型组比较,梓醇30mg/kg给药组均能显著的升高PI3K、Akt蛋白表达量,明显降低PI3KmRNA而升高AktmRNA的表达水平,差异均有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。结论：梓醇可促进PI3K、Akt蛋白及mRNA水平的表达。梓醇可能通过促进内源性神经营养因子及其受体的表达,激活PI3K/Akt信号转导通路,使Akt活化,进而调节该通路下游的效应分子,抑制细胞凋亡,促进神经元存活、修复再生,改善脑缺血后大鼠的神经功能障碍。课题创新点：1.大鼠脑缺血恢复早期（脑缺血后3-14d）神经功能障碍较急性期和恢复期表现明显,病理生理变化较稳定,因此,在该时间窗研究药物改善大鼠脑缺血损伤神经功能障碍贴近于临床缺血性脑卒中神经功能障碍患者,切入时间窗具有新颖性。2.结合脑缺血恢复早期脑组织病理生理变化的特点,从细胞凋亡-内源性神经营养因子-能量代谢障碍-氧化损伤-炎症反应等多因素观察梓醇口服给药对大鼠脑缺血损伤神经功能障碍的改善作用,多角度的探讨了梓醇口服给药对脑缺血恢复早期神经功能障碍恢复的作用及其可能的作用环节。3.围绕脑缺血损伤后神经功能障碍的行为学表现,结合神经保护和神经修复相关因子（NGF/TrKA,BDNF/TrKB）和PI3K/Akt经典信号通路中PI3K、Akt水平的变化展开梓醇对脑缺血损伤后神经保护和神经修复作用的机理探讨。确认梓醇在脑缺血恢复早期（3-14d）口服给药能促进脑皮层内源性神经营养因子及其受体的表达,进而激活了PI3K/Akt信号通路,从而抑制神经细胞凋亡,改善能量代谢障碍,抗氧化损伤,促进神经功能的恢复,具有明显的脑保护作用。
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