论文摘要
目的:观察阿米洛利对大鼠全脑缺血/再灌注损伤的影响。方法:1.实验分组及动物模型制备雄性清洁级SD大鼠48只,月龄33.5月,体重250310g。随机分为4组（n=12）:假手术组（S组）,缺血/再灌注组（I/R组）,生理盐水组（NS组）,阿米洛利组（A组）。采用三血管阻断法制备全脑缺血/再灌注模型。麻醉后分离双侧颈总动脉、气管切开,在枕骨斜坡部位开一约3 mm×2 mm的骨窗,暴露基底动脉,在基底动脉第二无血管区穿线备用。将大鼠固定于脑立体定位仪上,以前囟为原点,后移2.0 mm,右移3.0 mm,用颅钻以此坐标点为圆心钻一直径约3 mm的孔,用细针挑破硬膜,微透析针在上述坐标点刺入脑组织3.5 mm。稳定1 h后开始收集微透析液,连续收集6管,每管10 min。在收集完T1后,S组不作任何操作,观察8 h;I/R组双侧颈总动脉动脉夹夹闭、基底动脉阻断,维持10 min,再灌注8 h;NS组和A组:灌注前即刻股静脉输入0.9%NaCl 6 ml/kg或阿米洛利0.6 mg/kg,其他同I/R组。2.检测指标及检测方法2.1各组动物体重,月龄2.2脑组织微透析液乳酸脱氢酶法呈色,比色法测乳酸浓度,公式为:微透析液中乳酸含量=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准浓度（3 mmol/l）×样本测试前稀释倍数2.3再灌注8小时神经行为学评分格子爬行试验（OFT）:将大鼠放入大小为1 m×1 m×0.4m的分析箱,箱底被均分25个方格,观察5 min内大鼠跨格次数（计数标准为三爪以上均入邻格）。斜板试验（IPT）:将大鼠头向下置于45°倾斜的木板上,记录大鼠本能转为头向上所需的时间。2.4脑水含量缺血/再灌注8 h后断头,取右侧大脑半球,干湿重法计算脑水含量（200℃,8h）,公式为:脑水含量（%） = （湿重-干重）/湿重×100%2.5电子显微镜观察脑神经元超微结构变化上述大鼠左侧大脑半球同一部位切取1 mm×1 mm×1 mm的组织块,于4℃4%戊二醛中固定1 h以上,送电镜实验室在透射电镜下观察皮质神经元的超微结构。2.6光镜下观察脑神经元病理改变在再灌注8 h麻醉后,活体固定,断头取大脑,置于4%多聚甲醛中固定,HE染色,在400倍光镜下观察皮质神经元的病理学改变。2.7免疫组织化学观察ASIC2b变化取标本、切片制作方法同光镜标本,切片与一抗、二抗和显色剂作用,显色后在400倍光镜下观察ASIC2b变化。结果1各组动物的体重、月龄差异均无统计学意义（P>0.05）2神经行为学评分OFT:与S组比较,I/R组、NS组和A组大鼠爬格子数减少,与I/R组和NS组比较,A组大鼠爬格子数较多（P<0.05）;I/R组与NS组比较显差异无统计学意义（P>0.05）。IPT:与S组比较,I/R组、NS组和A组大鼠转头时间延长,与I/R组和NS组比较,A组大鼠转头时间延长（P<0.05）;I/R组与NS组比较显差异无统计学意义（P>0.05）。3脑水含量与S组比较,I/R组、Na和S组脑水含量增加,与NS组和I/R组比较,A组脑水含量减少（P<0.05）;I/R组与NS组之间差异无统计学意义（P>0.05）。4光镜下观察神经元病理学改变S组神经元细胞形态结构基本正常,均匀淡染,核圆形,核仁清楚;I/R组大部分神经细胞固缩,嗜伊红性增强,核浆分界不清;NS组,部分神经细胞固缩,嗜伊红性强,核浆分界不清,核仁不清;A组,部分神经细胞轻度固缩,结构基本正常,核椭圆形,核仁清楚。5电子显微镜观察神经元细胞超微结构变化S组:神经元结构基本正常,细胞器完整,数量无减少,线粒体极少部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网轻度脱颗粒现象,高尔基体基本正常。I/R组:神经元高度水肿,细胞器数量显著减少,线粒体部分或大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,次级溶酶体融合。NS组:细胞质明显水肿,细胞器数量明显减少,线粒体大部分或全部嵴或大部分膜融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,次级溶酶体数量显著减少。A组:神经元结构基本正常,细胞质有轻度水肿,线粒体部分嵴融合或消失,粗面内质网轻度脱颗粒现象,可见次级溶酶体。6微透析液乳酸浓度每组各时间段比较:S组各时段间差异无统计学意义（P>0.05）;其余三组,与T1比较,T2T6,乳酸浓度均升高（P<0.05）。组间比较,T1、T2,各组间差别无统计学意义（P>0.05）;T4T6,乳酸浓度S组较NS组、I/R组和A组低（P<0.05）,A组较NS组、I/R组低（P<0.05）,NS组与I/R相比差异无统计学意义（P>0.05）。7免疫组化ASIC2b在海马Ca1区的表达S组,ASIC2b阳性细胞较多,且染色深。I/R组,ASIC2b阳性细胞几乎见不到。NS组,ASIC2b阳性细胞较少。A组,ASIC2b阳性细胞较多。与S组比较,I/R组、NS组、A组评分减少,与I/R组相比,A组评分增加（P<0.05）,I/R组与NS组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:阿米洛利对全脑缺血再灌注损伤的脑组织有保护作用,ASIC被激活是大鼠全脑缺血再灌注损伤的机制之一。
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