大白菜核不育复等位基因的分子标记及定位

论文摘要

本研究以大白菜核基因雄性不育“两用系”AB01的不育株与大白菜自交系Chiifu（多国芸薹属基因组测序计划的模式植物）杂交、回交所构建的BC1群体为试材，进行AFLP和SSR分析，获得了多个与大白菜核不育复等位基因Ms连锁的AFLP和SSR标记，并将位于目标基因两侧，遗传距离最近的2个AFLP标记转化为SCAR标记，构建了Ms基因区域的SCAR及SSR标记遗传连锁图谱，从而对不育基因位点进行了染色体定位。此外，通过对AB01进行SSR分析，使我们获得了1个与育性恢复基因Msf连锁的SSR标记，并对雄性不育基因Ms与其恢复基因间Msf的等位性关系进行了探讨。主要试验结果如下。1．用已知基因型的4份材料对大白菜自交系Chiifu进行测交，基于后代育性分离比率，鉴定出Chiifu在核不育位点上的基因型为msms。以甲型“两用系”AB01不育株为母本，与Chiifu杂交，构建BC1分离群体，共244株，其中可育114株，不育130株，经χ2测验符合1：1分离比率，适合用于分子标记分析。2．以BC1群体为试材，采用AFLP+BSA的方法，对256对PstI+GNN／MseI+CNN引物组合进行多态性筛选。在亲本及基因池间的引物筛选中，检测出16个与核不育基因Ms连锁的候选标记。经个体验证，筛选出6个与Ms基因紧密连锁的AFLP标记。将标记在群体中的分布数据输入MAPMAKER／EXP 3．0，构建了目标基因区域的AFLP图谱。该图谱覆盖了15 cM区域，标记P01和P04位于目标基因两侧，遗传距离分别为2．5和3．8 cM。其余标记P10，P12，P07和P11均位于P04一侧，与Ms基因间的遗传距离分别为6．3，10，12．5和12．5 cM。3．将位于不育基因Ms两侧的两个AFLP标记P01和P04的特异条带回收、克隆、测序，根据所获得的序列重新设计引物，成功的转化出位于Ms基因两侧的SCAR标记，并命名为syauscr01和syauscr04。如果共同使用这两个标记，理论选择正确率几乎可以达到100％，可用于大白菜核不育复等位基因Ms的分子标记辅助选择。4．以构建BC1群体的双亲为试材，优化SSR反应体系。优化后的SSR反应体系为：1×buffer(10 mmol·L-1 Tris-HCL，50 mmol·L-1 KCL)，2 ng·μl-1模板DNA，1U Taq DNA聚合酶，0．35 mmol·L-1dNTPs，0．4μmol·L-1引物，2 mmol·L-1Mg2+，最后加超纯水定容至20μl。以上述SSR反应体系为基础，利用BC1分离群体，对Ms基因进行了SSR分析。首先，在双亲间对多国芸薹属基因组测序项目（BrGSP）开发的286对SSR引物进行了多态性筛选，其中182对在双亲间扩增出多态性条带，多态性引物比例高达68％。经过在基因池及单株上验证，筛选出3个与Ms基因紧密连锁的SSR标记，分别为cnum273，cnum030和cnum295。这3个标记均来自大白菜A07连锁群。为了开发出遗传距离更近的SSR标记，在A07连锁群上特定区域内的7个BAC克隆上，设计并开发了14对SSR引物，又筛选出一个与Ms基因紧密连锁的SSR标记syaum13。经连锁遗传分析，构建了Ms基因区域的SCAR及SSR标记连锁图谱。该图谱覆盖9 cM区域，2个SCAR标记（syauscr01和syauscr04）位于Ms基因两侧，遗传距离分别为0．8和2．5 cM，4个SSR标记（syaum13、cnum273、cnum030和cnum295）位于syauscr04一侧，遗传距离分别为3．3，6．2，7．8和8．6 cM。根据BrGSP构建的大白菜A07连锁群的遗传连锁图上，syaum13位于该连锁群26．9 cM处。据此，将大白菜核不育复等位基因Ms定位于A07连锁群的26．9 cM附近的3．3 cM范围内。5．以可育株与不育株1：1分离的大白菜雄性不育“两用系”AB01为群体，在可育池（MsfMs）与不育池（MsMs）间，对位于A07上的54对SSR引物进行多态性筛选。经过单株验证，获得了1个与育性恢复基因Msf连锁的SSR标记pbcmENA6a。该标记与Msf基因间的遗传距离为7．8 cM。将Ms基因区域的SCAR和SSR标记图谱及Msf基因区域的SSR图谱，与BrGSP构建的大白菜A07连锁群遗传图谱进行比对，证明了Msf和Ms基因均位于A07连锁群0-26．9 cM范围内，对二者间的等位性关系进行了初步的探讨。该结果为进一步揭示该位点的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 一、植物雄性不育的遗传机制
• 二、芸薹属农作物雄性不育
• （一） 细胞质雄性不育
• （二） 细胞核雄性不育
• 三、分子标记技术在芸薹属作物上的应用
• （一） 分子标记的发展
• （二） 芸薹属作物分子标记遗传图谱的构建
• （三） 芸薹属作物重要基因的标记及定位
• （四） 分子标记辅助选择在芸薹属作物遗传育种中的应用
• （五） 关于多国芸薹属基因组测序项目（BrGSP）
• 第二章 大白菜核不育基因Ms的AFLP标记
• 一、材料与方法
• （一） 试材
• （二） Chiifu基因型的鉴定
• （三） 分离群体的构建
• （四） DNA提取及样品集团的构建
• （五） AFLP分析
• 二、结果与分析
• （一） 测交群体中Ms位点的遗传分析
• （二） 分离群体的构建
• （三） 与核不育复等位基因Ms连锁的AFLP标记
• （四） 核不育基因Ms的AFLP连锁图谱
• 三、讨论
• 第三章 大白菜核不育基因Ms的SCAR标记
• 一、材料与方法
• （一） 材料
• （二） 目标片段的二次扩增及纯化
• （三） 连接反应
• （四） 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• （五） 阳性克隆的鉴定
• （六） 菌液扩增
• （七） 克隆片段的测序及其序列相似性分析
• （八） SCAR引物设计
• （九） PCR扩增和群体分析
• （十） 连锁遗传分析
• 二、结果与分析
• （一） 差异片段的回收与克隆
• （二） 差异片段的序列测定及SCAR标记检测
• （三） 标记位点序列的生物信息学分析
• （四） 遗传距离的计算
• 三、讨论
• 第四章 大白菜核不育复等位基因Ms的定位
• 一、材料与方法
• （一） 分离群体的构建
• （二） DNA提取及样品集团的构建
• （三） SSR反应体系的优化
• （四） PCR反应
• （五） 电泳及银染
• （六） 连锁遗传分析
• 二、结果与分析
• （一） SSR体系的优化
• （二） 亲本及基因池间多态性引物的筛选
• （三） 候选SSR标记的单株验证
• （四） 核不育基因Ms的SSR和SCAR图谱
• （五） SSR标记与拟南芥基因组序列比对结果
• 三、讨论
• f的等位性验证'>第五章 大白菜核不育基因Ms与其恢复基因Ms^f的等位性验证
• 一、材料与方法
• （一） 试材
• f的定位'>（二） 育性恢复基因Ms^f的定位
• f与Ms的等位性验证'>（三） Ms^f与Ms的等位性验证
• 二、结果与分析
• f连锁的SSR标记'>（一） 与育性恢复基因Ms^f连锁的SSR标记
• f的定位'>（二） 育性恢复基因Ms^f的定位
• f与Ms等位性关系的分子验证'>（三） Ms^f与Ms等位性关系的分子验证
• 三、讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 大白菜基因组NDA提取方法
• 附录2 268对SSR引物在双亲间的筛选结果
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表文章