穗茎注射法导入反义PLD_γ基因小麦的分子检测及性状鉴定

论文摘要

本研究利用改良的穗茎注射法将反义PLD? 基因导入普通小麦兰考906,在卡那霉素筛选的基础上,进行了特异PCR 扩增、PCR-Southern杂交检测,结果证明反义PLD?基因整合到了受体的染色体中;同时对转基因株系与受体在蛋白质水平上的表达、耐盐性、白粉病抗性、相关品质性状及主要农艺性状上的差异进行了研究,主要结果如下: 1. 首次获得了转反义PLD?基因小麦植株。对卡那霉素筛选的抗性苗,经特异PCR 扩增,3 个材料扩增出与阳性质粒大小相同的400bp 的目的片段,PCR-Southern杂交结果与扩增结果一致,说明该基因整合到小麦的基因组中,获得了转基因小麦植株。2. 醇溶蛋白电泳结果显示,转基因株系与受体相比存在着显著的差异,主要体现在转基因后代中出现了新带或者缺少了受体的部分谱带及表达量的差异。这表明因反义PLD?基因的插入,导致原有编码基因的沉默和新基因的表达,从而使转基因株系产生了异于受体的蛋白质组分。3.麦谷蛋白电泳结果显示,转基因株系的HMW-GS 亚基组成发生了变化。转基因株系缺少了受体的10 亚基、新出现了受体所没有的8 和12亚基,这表明因基因的插入使转化株系的B、D 染色体（主要是D 染色体）发生了变化,从而改变了其HMW-GS 的组成情况。4. 转基因株系的抗性提高。耐盐水培鉴定和0.5%的混合盐土培鉴定结果及差异性检验表明,转基因株系的耐盐性均达到1 级或2 级水平,明显的优于受体。白粉病观察结果表明,受体兰考906 相对发病较重,转基因株系白粉病发病较轻或（近）免疫,呈现较强的抗性,说明PLD?反义基因具有提高转化材料的耐盐性和白粉病抗性的效应。5. 转基因株系的品质性状有所改善,其幅度大小因转化株系的不同而异。蛋白质含量、粉质参数、粘度参数等的测定结果表明,转基因株系较受体有所提高,大多差异达到显著、极显著水平,,其中提高幅度较大的有蛋白质含量、降落值、峰值粘度、低谷粘度、最终粘度等等,说明反义PLD?基因具有提高品质的功能。6. 转基因株系农艺性状变异广泛。转基因株系在农艺性状上与受体存在显著差异,主要表现为株高、千粒重、单株穗数增加,变化范围分别

论文目录

• 摘要
• 关键词
• Abstract
• Key words
• 英文缩略符号表
• 1 引言
• 1.1 磷脂与磷脂酶
• 1.1.1 磷脂酶D（PLD）的发现及其基因的克隆
• 1.1.2 PLD 的结构特点
• 1.1.3 酶反应特点
• 1.1.4 PLD 的生理作用
• 1.1.5 PLD 基因在植物育种上的应用潜力
• 1.2 外源DNA 导入技术研究
• 1.2.1 外源基因转化方法
• 1.2.2 外源DNA 转化体的验证
• 1.2.2.1 分子水平的验证
• 1.2.2.2 同工酶电泳技术
• 1.2.3 转基因技术在小麦遗传育种中的应用及展望
• 1.3 本研究的目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 研究材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 农杆菌菌株和质粒
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.3.1 小麦DNA 提取
• 2.1.3.2 质粒提取
• 2.1.3.3 电泳缓冲液配制
• 2.1.3.4 Southern杂交
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 目的基因转化
• 2.2.1.1 PLD?反义基因农杆菌的活化与培养
• 2.2.1.2 小麦的穗茎注射法处理
• 2.2.2 卡那霉素的有效筛选浓度
• 2.2.3 转化株系的PCR 检测
• 2.2.3.1 小麦DNA 提取
• 2.2.3.2 质粒DNA 碱法提取
• 2.2.3.3 特异PCR 扩增
• 2.2.3.4 PCR 扩增结果的电泳检测
• 2.2.4 PCR-Southern检测
• 2.2.5 醇溶蛋白电泳
• 2.2.6 HMW-GS 电泳
• 2.2.6.1 样品提取
• 2.2.6.2 凝胶电泳方法
• 2.2.7 转基因植株的耐盐性鉴定
• 2.2.7.1 水培实验
• 2.2.7.2 土培实验
• 2.2.8 材料种植与性状调查
• 2.2.9 数据分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 反义PLD?基因转化后代的卡那霉素筛选
• 3.2 反义PLD?基因转化体的特异PCR 扩增
• 3.3 反义PLD?基因转化体的PCR-Southern杂交
• 3.4 反义PLD?基因转化株系与受体在蛋白质水平上的差异
• 3.4.1 醇溶蛋白
• 3.4.2 HMW-GS 组成
• 3.5 转基因株系的抗性表现
• 3.5.1 耐盐性
• 3.5.1.1 耐盐指数
• 3.5.1.2 存活率
• 3.5.2 白粉病抗性
• 3.6 反义PLD?转基因株系的性状表现
• 3.6.1 品质特性
• 3.6.1.1 蛋白质特性
• 3.6.1.2 淀粉特性
• 3.6.2 农艺性状
• 3.7 转基因株系的雄性不育性表现
• 4. 讨论
• 4.1 穗茎注射法应用的可行性
• 4.2 生物基因表达的反义调控
• 4.3 转反义PLD?基因小麦检测方法的评价
• 4.3.1 卡那霉素筛选
• 4.3.2 特异PCR 扩增
• 4.3.3 PCR-Southern杂交
• 4.4 转基因小麦的耐盐筛选
• 4.5 转基因株系品质性状的变化
• 4.6 转基因株系农艺性状的变异
• 4.7 转基因株系雄性不育性的出现
• 4.8 磷脂酶作用机理的进一步探讨
• 4.9 进一步的研究设想
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文