论文摘要
我国每年肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）新发病例和死亡病例均在30万以上,发病率和死亡率均居全球之首,并且近年来发病率呈上升趋势,HCC对国人的生命健康已构成严重危害。虽然目前治疗HCC的方法很多,但效果欠佳。复发转移是影响疗效的最主要障碍,而且肝癌细胞如何获得侵袭转移潜能目前尚不十分清楚。因此进一步探讨HCC侵袭转移的分子机制有重要的理论意义和临床实用价值。既往认为血管内皮细胞生长因子受体-1（vascular endothelial growth factor receptor-1,VEGFR-1）主要在内皮细胞表达,但新近研究发现在多种上皮来源的恶性肿瘤细胞如胰腺癌、乳腺癌和结肠癌等实体癌细胞中也有表达,而且上调表达的VEGFR-1与肿瘤侵袭和转移有关,但确切的机制还不清楚。HCC作为富含血管的上皮来源的恶性肿瘤,已证实其血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）呈高表达,但在HCC组织中有无VEGFR-1表达及其在HCC侵袭转移过程中发挥怎样的作用并如何发挥作用,尚未见系统研究。为了明确HCC有无VEGFR-1表达及其在HCC侵袭转移过程中的可能作用,本实验设计如下:首先,用免疫组化方法检测VEGFR-1、上皮标志物（E-cadherin、α-catenin）、间叶标志物（N-cadherin、Vimentin）在HCC组织中的表达情况,并探讨VEGFR-1表达与HCC临床病理学因素和肝癌细胞各表型标志物之间的相关性以明确VEGFR-1表达在HCC侵袭转移过程中的可能作用;然后筛选表达VEGFR-1的肝癌细胞株作为体外实验的靶细胞,用RT-PCR、Western blotting和细胞荧光免疫组化等方法检测上皮标志物和间叶标志物在VEGFR-1活化前后的改变以探讨VEGFR-1活化能否诱导肝癌细胞发生上皮-间叶表型转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。最后给予c-Src激酶抑制剂PP2,探讨VEGFR-1活化诱导的上皮-间叶表型转化（EMT）是否由Src激酶信号转导通路介导。主要结果和结论如下:1. 82例肝细胞癌组织标本中,有59例表达VEGFR-1,阳性表达率71.95%（59/82）;上皮标志物在肝细胞癌中的表达情况是,52例标本E-cadherin表达缺失（52/82,63.41%）,30例（30/82,36.59%）正常阳性表达;α-catenin有39例（39/82, 47.56%）表达缺失,43例（43/82, 52.44%）呈正常阳性表达;N-cadherin有37例（37/82, 45.12%）表达阳性,Vimentin有44例（44/82, 53.66%）表达阳性。统计分析显示,上皮标志物E-cadherin、α-catenin在肝癌细胞膜上的表达下降或缺失,以及N-cadherin、Vimentin等间叶标志物在肝癌细胞浆中的阳性表达均与肿瘤分期、分化、肿瘤包膜和静脉侵袭等临床病理学因素显著相关（P<0.05）;统计分析还表明,VEGFR-1表达与肝细胞癌的肿瘤分期、分化、静脉侵袭和肿瘤包膜完整等侵袭转移相关的病理学因素显著相关（P<0.05）,并且与E-cadherin表达缺失和Vimentin、N-cadherin阳性表达相关（P<0.05）;这就提示,在肝细胞癌中VEGFR-1促肝癌侵袭转移的作用可能与诱导肝癌细胞发生上皮-间叶表型转化（EMT）有关。2.在检测的四株人肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L、SMMC-7721、HepG2和正常人肝细胞株L-02中,具有转移潜能的肝癌细胞株有VEGFR-1 mRNA和蛋白表达,而且VEGFR-1的表达水平与肝癌细胞的侵袭转移潜能呈正相关,即高转移潜能的肝癌细胞其VEGFR-1的表达也高。在检测的四株肝癌细胞中MHCC97-H有100%发生肺转移的潜能,其VEGFR-1 mRNA和蛋白质表达水平也最高,因此完全可以用MHCC97-H作为下一步体外研究的靶细胞,以明确VEGFR-1活化能否诱导肝癌细胞发生上皮-间叶表型转化（EMT）。3. VEGF-B处理MHCC97-H细胞48h后,细胞极性丧失,呈梭形、纺锤样细胞形态,细胞-细胞间隙增宽说明细胞间粘附丧失,并且从细胞膜伸出伪足。而对照组细胞维持母细胞的上皮样表型;给予VEGFR-1的中和抗体18F1预处理后,VEGF-B刺激并不能改变MHCC97-H细胞形态,仍维持母细胞的上皮样表型,这初步提示VEGFR -1活化可能诱导了肝癌细胞发生上皮-间叶表型转化（EMT）。通过RT-PCR、Western blotting和细胞荧光免疫组化等方法进一步检测了VEGFR-1活化后肝癌细胞表型标志物表达的改变,发现实验组细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的表达水平显著低于对照组,而且E-cadherin和α-catenin的表达部位也发生了改变,即在胞膜表达减少,胞浆中的表达增加;间质标志物N-cadherin、Vimentin在实验组细胞中的表达显著高于对照组,N-cadherin、Vimentin在胞浆中的表达明显增加;细胞迁移和细胞侵袭试验结果显示,VEGF-B处理MHCC97-H细胞后,细胞迁移和侵袭能力显著高于对照组,说明VEGFR-1活化诱导肝癌细胞发生EMT后,增强了肝癌细胞的迁移和侵袭能力。实验组给予VEGFR-1的中和抗体18F1预处理后能够阻断上述效应的发生。这进一步提示,VEGFR-1活化能诱导肝癌细胞发生EMT。4.干预实验结果表明,给予c-Src激酶特异性抑制剂PP2后,VEGF-B不能诱导MHCC97-H细胞发生与EMT一致的形态学改变,细胞仍维持上皮细胞特征,细胞-细胞连接紧密,上皮细胞标志物E-cadherin和α-catenin仍大部分在胞膜表达,而且蛋白表达量与对照组相比没有明显下调（P>0.05）;间叶标志物Vimentin和N-cadherin仍在胞浆少量表达,而且蛋白表达量与对照组相比没有明显上调（P>0.05）;细胞迁移和侵袭试验结果提示,在给予PP2后,VEGFR-1活化不能增强MHCC97-H细胞的迁移和侵袭能力。给予PP2的阴性对照PBS处理后,VEGF-B刺激仍可使MHCC97-H细胞发生与EMT一致的细胞形态学改变,即细胞-细胞紧密连接,细胞呈多角形等,上皮标志物E-cadherin、α-catenin胞膜表达减少并且胞浆表达增多,间叶标志物Vimentin、N-cadherin胞浆表达增多;细胞迁移和侵袭试验结果表明,在给予PBS后,VEGF-B刺激MHCC97-H细胞使细胞迁移和侵袭能力显著增加（P<0.05）。上述结果均提示发挥抑制作用的是PP2。因为Src激酶信号通路是癌细胞发生上皮-间叶表型转化（EMT）的重要信号转导通路之一,而PP2被证明是Src选择性的酪氨酸激酶抑制剂并且被广泛用于研究有关Src激酶的信号转导通路。因此我们认为VEGFR-1活化诱导的肝癌细胞发生上皮-间叶表型转化（EMT）是由Src激酶信号转导通路介导的,Src是VEGFR-1活化诱导肝癌细胞上皮-间叶表型转化（EMT）的关键因子之一,靶向抑制Src可能是干预HCC侵袭转移的有效方法。综上所述,本研究主要结论如下:1.人肝细胞癌组织中存在VEGFR-1表达,且其表达与肝细胞癌侵袭转移和预后有关,VEGFR-1可能是预测肝细胞癌侵袭转移潜能和预后的指标之一;2. VEGFR-1活化通过诱导上皮-间叶表型转化（EMT）促进肝细胞癌侵袭转移;3. VEGFR-1活化诱导肝癌细胞MHCC97-H发生上皮-间叶表型转化（EMT）是由Src激酶通路介导的,Src作为该信号通路的关键因子之一,可能是干预肝细胞癌侵袭转移的有效靶点。
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标签：肝细胞癌论文; 血管内皮细胞生长因子受体论文; 上皮间叶表型转化论文; 侵袭转移论文;