论文摘要
鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。VP2是IBDV的主要表面结构蛋白,在诱导机体产生特异性中和抗体中起主要作用。人工表达VP2可形成包含20个VP2三聚体的病毒样颗粒,该病毒样颗粒能作为展示小分子外源抗原的载体。H5亚型高致病性禽流感对我国养禽业造成巨大经济损失,并严重威胁公共卫生安全。我国针对禽流感已研发出5代灭活疫苗,但防控形势依然严峻。能对不同变异株甚至不同亚型流感病毒均能提供保护的“通用型”疫苗成为目前国际流感疫苗研究热点,其中M2蛋白因其高度保守性已成为“通用型”疫苗的靶抗原的主要选择之一。本文以IBDV VP2蛋白为载体,在其PBC区插入单拷贝的AIV M2e基序,或在C端融合4拷贝AIV M2e基序,分别用大肠杆菌表达系统和杆状病毒表达系统进行表达,并初步对其免疫原性进行研究,为研制既可预防IBD又能预防AI的新型疫苗打下基础。主要研究内容如下：一、重组基因的构建根据GenBank发表IBDV的VP2序列,设计系列引物,利用融合PCR在VP2基因的PBC区或羧基端插入不同的M2e基因。在VP2基因的PBC区插入单拷贝H5或H9AIV M2e基因,获得VP2-BCM2eH5、VP2-BCM2eH9重组基因；在VP2基因的羧基端融合4拷贝H5或H9AIV M2e基因,并在VP2和4M2e之间添加连接子（KK）,获得VP2-KK-4M2eH5和VP2-KK-4M2eH9。将重组基因克隆到pMD19-T载体,经测序鉴定获得目的重组基因。二、重组基因在大肠杆菌中的表达及鉴定将构建的重组基因克隆至原核表达载体pET-32a （+）,获得原核表达载体pET32a-VP2-BCM2eH5、pET32a-VP2-BCM2eH9、pET32a-VP2-KK-4M2eH5和pET32a-VP2-KK-4M2eH9,并经测序验证。转化至大肠杆菌BL21-DE3,经IPTG诱导表达,并对相应诱导表达条件进行优化,包括温度、IPTG浓度、诱导后培养时间等。4种重组基因的表达产物经SDS-PAGE分析表明,均获得目的蛋白条带,进一步经Western-blotting鉴定,融合蛋白与相应针对IBDV的单因予血清具有较好的反应性。三、重组基因在杆状病毒系统中表达及鉴定将构建的的VP2-BCM2eH5、VP2-BCM2eH9、VP2-KK-4M2eH5和VP2-KK-4M2eH9基因分别克隆至杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的pFastBac-1中,获得pF-VP2-BCM2eH5、pF-VP2-BCM2eH9、pF-VP2-KK-4M2eH5和pF-VP2-KK-4M2eH9重组质粒。重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌,经与Bacmid同源重组获得重组穿梭载体Bac-VP2-BCM2eH5、Bac-VP2-BCM2eH9、 Bac-VP2-KK-4M2eH5和Bac-VP2-KK-4M2eH9。将重组Bacmid转染sf-9细胞获得重组病毒rBac-VP2-BCM2eH5、rBac-VP2-BCM2eH9、rBac-VP2-KK-4M2eH5和rBac-VP2-KK-4M2eH9。对表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析可见特异性目的条带,表明重组蛋白在sf-9细胞中成功表达。间接免疫荧光进-步验证表达蛋白的获得良好表达。四、免疫原性研究将获得表达蛋白与白油佐剂进行乳化制备疫苗,免疫2周龄的非免疫鸡。随机分组10只／组,共8个免疫组,同时设立IBDV基因工程亚单位疫苗对照组、H5AIV灭活苗对照组、H9AIV灭活苗对照组、pET32a对照组、空Bac对照组、空白对照组。经颈部皮下免疫,1免4周后加强免疫,加强免疫后4周用IBDV攻毒。初次免疫和加强免疫后每2周采血分离血清,利用间接ELISA方法检测VP2蛋白特异性抗体和M2e蛋白特异性抗体。利用病毒血清中和试验测定抗血清在CEF细胞上的中和效价。结果表明,各重组蛋白免疫组在2免后第4周抗体达到高峰,IBDV病毒细胞中和试验效价最高达1：6400。IBDV攻毒结果显示,绝大多数鸡未出现明显的临床症状,临床保护率为100%,其中pF-VP2-BCM2eH5、pF-VP2-4M2eH5和pF-VP2-4M2eH9三组的保护效果最好。
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